| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-24页 |
| 1.1 引言 | 第12-13页 |
| 1.2 鸭病毒性肝炎概述 | 第13-14页 |
| 1.2.1 分类与分布 | 第13-14页 |
| 1.2.2 病原学 | 第14页 |
| 1.2.3 流行病学 | 第14页 |
| 1.3 Ⅰ型鸭病毒性肝炎概述 | 第14-20页 |
| 1.3.1 病原学研究 | 第14-17页 |
| 1.3.1.1 DHV-Ⅰ的分类地位 | 第14-15页 |
| 1.3.1.2 生物学特性 | 第15页 |
| 1.3.1.3 DHV-Ⅰ的增殖培养 | 第15-16页 |
| 1.3.1.4 DHV-Ⅰ的致病性 | 第16-17页 |
| 1.3.2 Ⅰ型鸭肝炎病毒的基因组及其功能 | 第17-20页 |
| 1.3.2.1 小核糖核酸病毒的基因组结构及其功能 | 第17-18页 |
| 1.3.2.2 DHV-Ⅰ的基因组及其主要结构 | 第18-20页 |
| 1.4 DHV-Ⅰ的诊断技术研究 | 第20-24页 |
| 1.4.1 临床诊断 | 第20页 |
| 1.4.2 病毒分离 | 第20页 |
| 1.4.3 血清学方法 | 第20-22页 |
| 1.4.3.1 中和试验 | 第20-21页 |
| 1.4.3.2 琼脂扩散实验 | 第21页 |
| 1.4.3.3 凝集实验 | 第21页 |
| 1.4.3.4 酶联免疫吸附试验 | 第21-22页 |
| 1.4.3.5 胶体金技术 | 第22页 |
| 1.4.4 分子生物学方法 | 第22-24页 |
| 第二章 材料与方法 | 第24-41页 |
| 2.1 载体、菌种与血清 | 第24页 |
| 2.2 主要试剂与器材 | 第24-25页 |
| 2.2.1 主要试剂 | 第24页 |
| 2.2.2 主要器材(表2-1) | 第24-25页 |
| 2.3 主要试剂配制 | 第25-27页 |
| 2.3.1 质粒提取试剂 | 第25-26页 |
| 2.3.2 核酸电泳试剂 | 第26页 |
| 2.3.3 感受态细胞制备试剂 | 第26页 |
| 2.3.4 原核表达所需试剂 | 第26页 |
| 2.3.5 蛋白质电泳和Western blot所需试剂 | 第26-27页 |
| 2.3.6 蛋白纯化溶液 | 第27页 |
| 2.3.7 ELISA试剂 | 第27页 |
| 2.4 重组载体的构建和表达 | 第27-36页 |
| 2.4.1 DHV-Ⅰ VP648基因的克隆 | 第27-29页 |
| 2.4.1.1 Ⅰ型鸭肝炎病毒的增殖 | 第27-28页 |
| 2.4.1.2 病毒总RNA的提取 | 第28页 |
| 2.4.1.3 RT-PCR | 第28页 |
| 2.4.1.4 引物的设计与合成 | 第28页 |
| 2.4.1.5 目的基因VP648的扩增 | 第28页 |
| 2.4.1.6 PCR产物的纯化回收 | 第28-29页 |
| 2.4.2 重组质粒pET-VP648的构建 | 第29-33页 |
| 2.4.2.1 质粒载体的制备 | 第30页 |
| 2.4.2.2 VP648基因和载体pET-30a(+)的双酶切及产物回收 | 第30页 |
| 2.4.2.3 目的片段和载体的连接 | 第30页 |
| 2.4.2.4 连接产物的转化 | 第30-31页 |
| 2.4.2.5 阳性重组质粒的筛选与鉴定 | 第31-33页 |
| 2.4.3 重组质粒pET-VP648的诱导表达及SDS-PAGE电泳 | 第33-34页 |
| 2.4.3.1 重组质粒pET-VP648的诱导表达 | 第33页 |
| 2.4.3.2 SDS-PAGE电泳 | 第33-34页 |
| 2.4.4 可溶性蛋白的制备及鉴定 | 第34-36页 |
| 2.4.4.1 包涵体蛋白的纯化及复性 | 第34-35页 |
| 2.4.4.2 可溶性蛋白Pro-VP648的Western blotting分析 | 第35-36页 |
| 2.5 VP3多克隆抗体的制备及鉴定 | 第36页 |
| 2.5.1 VP3多克隆抗体的制备 | 第36页 |
| 2.5.2 多克隆抗体wesern blot检测 | 第36页 |
| 2.6 可溶性蛋白浓度测定 | 第36-37页 |
| 2.7 间接ELISA方法的建立 | 第37-41页 |
| 2.7.1 间接ELISA法的实验操作 | 第37-38页 |
| 2.7.2 ELISA中各级试剂最佳工作浓度的确定 | 第38页 |
| 2.7.3 ELISA最佳工作时间的确定 | 第38-39页 |
| 2.7.3.1 阴性、阳性血清最佳工作时间的确定 | 第38页 |
| 2.7.3.2 二抗最佳工作时间的确定 | 第38-39页 |
| 2.7.3.3 底物(TMB)最佳显色时间的确定 | 第39页 |
| 2.7.4 间接ELISA方法阳性、阴性临界值的确定及结果判定 | 第39页 |
| 2.7.5 重复性实验 | 第39页 |
| 2.7.5.1 批内重复实验 | 第39页 |
| 2.7.5.2 批间重复实验 | 第39页 |
| 2.7.6 特异性实验 | 第39-40页 |
| 2.7.6.1 特异性交叉实验 | 第39页 |
| 2.7.6.2 阻断实验 | 第39-40页 |
| 2.7.7 间接ELISA方法的初步应用 | 第40-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-55页 |
| 3.1 DHV-Ⅰ VP648基因的克隆 | 第41-45页 |
| 3.1.1 DHV-Ⅰ VP648基因的扩增 | 第41页 |
| 3.1.2 重组质粒的构建与鉴定 | 第41-43页 |
| 3.1.3 目的基因的表达分析 | 第43-45页 |
| 3.1.3.1 目的基因的诱导表达及纯化 | 第43页 |
| 3.1.3.2 蛋白表达的可溶性分析 | 第43-44页 |
| 3.1.3.3 可溶性蛋白的Western-blot分析 | 第44-45页 |
| 3.2 多克隆抗体wesern blot检测 | 第45-46页 |
| 3.3 蛋白的纯化及浓度测定 | 第46-48页 |
| 3.4 DHV-Ⅰ抗体检测间接ELISA方法的建立 | 第48-55页 |
| 3.4.1 ELISA中各级试剂最佳工作浓度的确定 | 第48-50页 |
| 3.4.2 ELISA最佳实验条件的确定 | 第50-52页 |
| 3.4.2.1 阴性、阳性血清最佳工作时间的确定 | 第50-51页 |
| 3.4.2.2 二抗最佳作用时间的确定 | 第51页 |
| 3.4.2.3 底物最佳作用时间的确定 | 第51-52页 |
| 3.4.3 间接ELISA阴、阳性临界值的确定及结果判定 | 第52页 |
| 3.4.4 重复性实验 | 第52-53页 |
| 3.4.5 特异性实验 | 第53页 |
| 3.4.5.1 阻断实验 | 第53页 |
| 3.4.5.2 特异性交叉实验 | 第53页 |
| 3.4.6 间接ELISA方法的应用 | 第53-55页 |
| 第四章 讨论 | 第55-58页 |
| 4.1 DHV-I结构蛋白的研究 | 第55页 |
| 4.2 表达系的选择 | 第55-56页 |
| 4.3 包涵体的优势及复性 | 第56-57页 |
| 4.4 间接ELISA方法的建立 | 第57-58页 |
| 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
