| 符号说明 | 第4-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第14-26页 |
| 1.1 辣椒疫病的发生规律与防治方法 | 第14-16页 |
| 1.1.1 辣椒疫霉生物学特征 | 第14-15页 |
| 1.1.2 辣椒疫病症状表现 | 第15-16页 |
| 1.1.3 辣椒疫病的发病原因及途径 | 第16页 |
| 1.2 辣椒疫病防治方法 | 第16-17页 |
| 1.2.1 物理防治 | 第16页 |
| 1.2.2 化学防治 | 第16-17页 |
| 1.2.3 生物防治 | 第17页 |
| 1.3 基因功能的相关研究进展 | 第17-25页 |
| 1.3.1 基因沉默 | 第17-18页 |
| 1.3.2 基因过表达 | 第18-19页 |
| 1.3.3 瞬时表达 | 第19-20页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9体系应用 | 第20-22页 |
| 1.3.4.1 CRISPR/Cas9的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.3.4.2 卵菌CRISPR/Cas9的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.3.5 效应分子研究进展 | 第22-25页 |
| 1.3.5.1 RxLR效应分子研究进展 | 第23-24页 |
| 1.3.5.2 CRN效应分子研究进展 | 第24-25页 |
| 1.4 实验目的及意义 | 第25-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-48页 |
| 2.1 材料 | 第26-30页 |
| 2.1.1 辣椒疫霉菌株及植物材料 | 第26页 |
| 2.1.2 载体和菌株 | 第26页 |
| 2.1.3 酶和生化试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.4 相关耗材和仪器 | 第27页 |
| 2.1.5 培养基 | 第27-28页 |
| 2.1.6 常用溶液和试剂的配制 | 第28-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-48页 |
| 2.2.1 辣椒疫霉RxLR效应分子的生物信息学分析及基本理化性质分析 | 第30-31页 |
| 2.2.2 实验所用引物 | 第31-32页 |
| 2.2.3 辣椒疫霉RxLR效应分子克隆 | 第32-36页 |
| 2.2.3.1 辣椒疫霉SD33菌株总DNA提取 | 第32-33页 |
| 2.2.3.2 辣椒疫霉SD33菌株总RNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.3.3 反转录cDNA第一链合成 | 第34页 |
| 2.2.3.4 辣椒疫霉RxLR效应分子基因克隆 | 第34-36页 |
| 2.2.4 农杆菌介导的辣椒疫霉RxLR效应分子瞬时表达 | 第36-42页 |
| 2.2.4.1 瞬时表达载体的构建 | 第36-37页 |
| 2.2.4.2 效应分子RxLR23截短体构建 | 第37-38页 |
| 2.2.4.3 农杆菌感受态细胞制备 | 第38-39页 |
| 2.2.4.4 冻融法转化农杆菌 | 第39页 |
| 2.2.4.5 农杆菌接种本氏烟和辣椒自交系叶片 | 第39页 |
| 2.2.4.6 RxLR效应分子抑制小鼠凋亡因子Bax引发的PCD的功能筛选 | 第39-40页 |
| 2.2.4.7 RxLR效应分子抑制INF1引发的PTI的功能筛选 | 第40页 |
| 2.2.4.8 RxLR效应分子抑制CRN4引发的ETI的功能筛选 | 第40页 |
| 2.2.4.9 共聚焦显微镜观察RxLR效应分子在本氏烟叶片中亚细胞定位 | 第40页 |
| 2.2.4.10 WesternBlot检测RxLR效应分子瞬时表达情况 | 第40-42页 |
| 2.2.5 利用CRISPR/Cas9体系敲除效应分子RxLR | 第42-48页 |
| 2.2.5.1 构建sgRNA重组载体 | 第42-43页 |
| 2.2.5.2 构建同源修复(HDR)供体质粒pBluescriptIIKS+重组载体 | 第43页 |
| 2.2.5.3 使用CRISPR/Cas9体系进行RxLR23基因敲除 | 第43-46页 |
| 2.2.5.4 辣椒疫霉菌丝的DAPI染色观察 | 第46页 |
| 2.2.5.5 辣椒疫霉菌侵染叶片的台盼蓝染色观察 | 第46-47页 |
| 2.2.5.6 辣椒疫霉菌致病性的检测 | 第47-48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-70页 |
| 3.1 辣椒疫霉RxLR效应分子基因克隆与序列分析 | 第48-52页 |
| 3.2 RxLR效应分子基因核定位序列预测 | 第52-54页 |
| 3.3 农杆菌瞬时表达RxLR效应分子 | 第54-62页 |
| 3.3.1 构建pBIN-GFP2重组载体及转化农杆菌GV | 第54-55页 |
| 3.3.2 各RxLR效应分子于植物叶片中瞬时表达 | 第55-62页 |
| 3.3.2.1 RxLR效应分子诱导本氏烟产生ETI的功能筛选 | 第55-56页 |
| 3.3.2.2 各RxLR效应分子诱导辣椒自交系叶片产生ETI的功能分析 | 第56页 |
| 3.3.2.3 各RxLR效应分子抑制小鼠凋亡因子Bax引发的PCD的功能分析 | 第56-57页 |
| 3.3.2.4 各RxLR效应分子抑制INF1引发的PTI的功能分析 | 第57-58页 |
| 3.3.2.5 各RxLR效应分子抑制CRN4引发的ETI的功能分析 | 第58-59页 |
| 3.3.2.6 筛选能够促进辣椒疫霉侵染的RxLR效应分子 | 第59页 |
| 3.3.2.7 WesternBlot检测各个效应分子的表达情况 | 第59-60页 |
| 3.3.2.8 RxLR效应分子的亚细胞定位情况 | 第60-61页 |
| 3.3.2.9 效应分子RxLR23诱导本氏烟产生ETI的关键功能域筛选 | 第61-62页 |
| 3.4 RxLR23敲除转化子的获得及生物学性状分析 | 第62-70页 |
| 3.4.1 sgRNA设计 | 第62页 |
| 3.4.2 SD33菌株中RxLR23上游1kb碱基序列及下游1kb碱基序列测序结果 | 第62-63页 |
| 3.4.3 RxLR23辣椒疫霉敲除转化子验证结果 | 第63-65页 |
| 3.4.4 RxLR23辣椒疫霉敲除转化子的生物学性状分析 | 第65-70页 |
| 3.4.4.1 RxLR23敲除转化子的生长速率分析 | 第65-66页 |
| 3.4.4.2 RxLR23敲除转化子菌丝的细胞核分布 | 第66-67页 |
| 3.4.4.3 RxLR23敲除转化子的致病性分析 | 第67-70页 |
| 4 结论与讨论 | 第70-74页 |
| 4.1 RxLR效应分子生物信息学分析 | 第70页 |
| 4.2 农杆菌瞬时表达RxLR效应分子 | 第70-71页 |
| 4.2.1 RxLR效应分子功能筛选 | 第70-71页 |
| 4.2.2 瞬时表达4个RxLR效应分子均能够在本氏烟叶片中正常表达 | 第71页 |
| 4.2.3 RxLR效应分子的亚细胞定位情况具有多样性 | 第71页 |
| 4.2.4 效应分子RxLR23诱导本氏烟产生ETI的关键功能域筛选 | 第71页 |
| 4.3 RxLR23敲除转化子的生物学表型分析 | 第71-74页 |
| 参考文献 | 第74-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 | 第85页 |
