| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-21页 |
| 1.1 聚酮合成酶 | 第10页 |
| 1.2 真菌Ⅰ型聚酮合成酶 | 第10-17页 |
| 1.2.1 甲基水杨酸聚酮合成酶 | 第11-12页 |
| 1.2.2 甲基水杨酸聚酮合成酶的异源表达 | 第12-13页 |
| 1.2.3 3-methylorcinaldehyde聚酮合成酶 | 第13页 |
| 1.2.4 橘霉素聚酮合成酶 | 第13-15页 |
| 1.2.5 橘霉素聚酮合成酶的异源表达 | 第15-16页 |
| 1.2.6 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase) | 第16-17页 |
| 1.3 过氧化物酶体对真菌次级代谢产物的影响 | 第17-18页 |
| 1.3.1 过氧化物酶体对橘霉素的影响 | 第18页 |
| 1.4 聚酮合成酶的异源表达及意义 | 第18-19页 |
| 1.4.1 聚酮合成酶异源表达的主要问题 | 第19页 |
| 1.5 毕赤酵母表达系统 | 第19-20页 |
| 1.5.1 毕赤酵母表达系统的发展及优点 | 第20页 |
| 1.5.2 基因整合 | 第20页 |
| 1.5.3 酵母转化 | 第20页 |
| 1.6 本课题的研究背景、创新点及课题意义 | 第20-21页 |
| 第2章 PPTase表达菌株的构建及活性测定 | 第21-39页 |
| 2.1 前言 | 第21-23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-28页 |
| 2.2.1 实验菌株和培养基 | 第23-24页 |
| 2.2.2 主要分子生物学试剂 | 第24页 |
| 2.2.3 缓冲液 | 第24-25页 |
| 2.2.4 构巢曲霉基因组的抽提 | 第25页 |
| 2.2.5 毕赤酵母感受态制备及电穿孔转化 | 第25-26页 |
| 2.2.6 毕赤酵母菌株在MM培养基中的诱导表达 | 第26页 |
| 2.2.7 用于镍柱纯化的毕赤酵母总蛋白提取 | 第26页 |
| 2.2.8 蛋白镍柱纯化 | 第26页 |
| 2.2.9 ACP和ACPm蛋白的诱导表达 | 第26-27页 |
| 2.2.10 大肠杆菌胞内上清蛋白的提取 | 第27页 |
| 2.2.11 CoA的荧光标记 | 第27页 |
| 2.2.12 引物设计及PCR条件 | 第27-28页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第28-38页 |
| 2.3.1 毕赤酵母GS115-NpgA-HIS6表达菌株的构建及诱导表达 | 第28-30页 |
| 2.3.2 橘霉素聚酮合成酶ACP功能域表达载体的构建 | 第30-34页 |
| 2.3.3 ACP和ACPm蛋白的表达 | 第34页 |
| 2.3.4 PPTase活性检测实验 | 第34-35页 |
| 2.3.5 毕赤酵母GS115-NpgA菌株的构建 | 第35-38页 |
| 2.4 本章小结 | 第38-39页 |
| 第3章 MSAS表达菌株的构建与产物检测 | 第39-55页 |
| 3.1 前言 | 第39页 |
| 3.2 实验材料及方法 | 第39-42页 |
| 3.2.1 实验菌株与质粒 | 第39页 |
| 3.2.2 培养基与培养条件 | 第39页 |
| 3.2.3 主要分子生物学试剂 | 第39页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第39-40页 |
| 3.2.5 引物设计及PCR条件 | 第40页 |
| 3.2.6 酵母RNA抽提 | 第40页 |
| 3.2.7 反转录PCR制备cDNA | 第40-41页 |
| 3.2.8 产物HPLC检测用条件 | 第41页 |
| 3.2.9 6-甲基水杨酸产量的测定 | 第41页 |
| 3.2.10 5L生物反应器发酵 | 第41-42页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第42-54页 |
| 3.3.1 6-MSAS转化株的构建 | 第42-46页 |
| 3.3.2 GS115-NpgA-atX菌株诱导表达后的的转录鉴定 | 第46-47页 |
| 3.3.3 GS115-NpgA-atX菌株的产物HPLC鉴定分析 | 第47-48页 |
| 3.3.4 GS115-NpgA-atX菌株的产物NMR鉴定 | 第48-50页 |
| 3.3.5 GS115-NpgA-atX菌株的产物EI-MS鉴定 | 第50-52页 |
| 3.3.6 5L发酵罐高密度发酵 | 第52-54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第4章 MOS表达菌株的蛋白及产物分析 | 第55-62页 |
| 4.1 前言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1 实验菌株与质粒 | 第55页 |
| 4.2.2 培养基与培养条件 | 第55页 |
| 4.2.3 主要分子生物学试剂 | 第55页 |
| 4.2.4 引物设计 | 第55页 |
| 4.2.5 聚酮合成酶的SDS-PAGE分析 | 第55-56页 |
| 4.2.6 产物萃取及HPLC检测用条件 | 第56页 |
| 4.2.7 酵母RNA的抽提及cDNA的制备 | 第56页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第56-61页 |
| 4.3.1 MOS转化株的构建 | 第56-59页 |
| 4.3.2 GS115-NpgA-Tspks1菌株诱导表达后的的转录鉴定 | 第59-60页 |
| 4.3.3 GS115-NpgA-Tspks1菌株菌株的产物HPLC鉴定分析 | 第60页 |
| 4.3.4 GS115-NpgA-Tspks1菌株诱导表达后的SDS-PAGE鉴定 | 第60-61页 |
| 4.4 本章小结 | 第61-62页 |
| 第5章 橘霉素表达菌株构建及产物检测 | 第62-76页 |
| 5.1 前言 | 第62页 |
| 5.2 实验材料 | 第62-63页 |
| 5.2.1 培养基及培养条件 | 第62页 |
| 5.2.2 紫红曲霉RNA的抽提及cDNA的制备 | 第62页 |
| 5.2.3 引物设计 | 第62页 |
| 5.2.4 NpgA的SDS-PAGE/Western blotting分析 | 第62-63页 |
| 5.2.5 HPLC检测用条件 | 第63页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第63-75页 |
| 5.3.1 GS115-NpgA-SKL和GS115-3.5K菌株的构建 | 第63-65页 |
| 5.3.2 橘霉素聚酮合成酶基因内含子的鉴定 | 第65-66页 |
| 5.3.3 橘霉素聚酮合成酶转化株的构建 | 第66-72页 |
| 5.3.4 pksCT异源表达后的转录鉴定 | 第72-73页 |
| 5.3.5 pksCT异源表达菌株诱导表达株NpgA的Western鉴定 | 第73页 |
| 5.3.6 pksCT异源表达菌株诱导表达株的产物HPLC分析 | 第73-75页 |
| 5.4 本章小结 | 第75-76页 |
| 第6章 结论与展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 附录 | 第82页 |
