| 目录 | 第7-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| ABSTRACT | 第11-12页 |
| 缩略语 | 第13-14页 |
| 第1章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.研究背景 | 第14-25页 |
| 1.1.唾液酸的发现 | 第14页 |
| 1.2.唾液酸的性质及检测 | 第14-15页 |
| 1.3.自然界中存在的唾液酸 | 第15-16页 |
| 1.4.唾液酸的生物学功能 | 第16-18页 |
| 1.5.唾液酸与疾病 | 第18-19页 |
| 1.6.唾液酸的制备方法 | 第19-22页 |
| 1.7.NAL和AGE概况 | 第22-25页 |
| 2.立题依据 | 第25-26页 |
| 第2章 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆 | 第26-37页 |
| 1.材料 | 第26-28页 |
| 1.1.试剂 | 第26页 |
| 1.2.菌种和质粒 | 第26-27页 |
| 1.3.培养基 | 第27页 |
| 1.4.缓冲液与溶液 | 第27-28页 |
| 1.5.主要实验仪器 | 第28页 |
| 2.方法 | 第28-32页 |
| 2.1.菌种的培养和保藏 | 第28页 |
| 2.2.碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA | 第28-29页 |
| 2.3.大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第29页 |
| 2.4.大肠杆菌质粒转化 | 第29页 |
| 2.5.DNA片段凝胶回收(V-gene DNA Gel Extraction Kit) | 第29-30页 |
| 2.6.质粒DNA的酶切 | 第30页 |
| 2.7.质粒与外源片段的连接 | 第30页 |
| 2.8.PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.9.RT-PCR反应 | 第31页 |
| 2.10.猪肾总RNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.11.微量制备鱼腥藻染色体 | 第32页 |
| 2.12.两种N-乙酰D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因亚克隆的构建 | 第32页 |
| 3.结果与讨论 | 第32-36页 |
| 3.1.猪肾总RNA的抽提 | 第32-33页 |
| 3.2.猪肾N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆 | 第33-34页 |
| 3.3.微量制备鱼腥藻染色体 | 第34页 |
| 3.4.鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆 | 第34-36页 |
| 4.结论 | 第36-37页 |
| 第3章 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的表达 | 第37-54页 |
| 1.材料 | 第37-40页 |
| 1.1.试剂 | 第37-38页 |
| 1.2.培养基 | 第38页 |
| 1.3.蛋白纯化亲和树脂 | 第38页 |
| 1.4.缓冲液与溶液 | 第38-39页 |
| 1.5.主要仪器设备 | 第39页 |
| 1.6.菌种和质粒 | 第39-40页 |
| 2.方法 | 第40-45页 |
| 2.1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第40页 |
| 2.2.菌体破碎 | 第40-41页 |
| 2.3.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶的纯化 | 第41页 |
| 2.4.蛋白含量的测定(Bradford法) | 第41-42页 |
| 2.5.猪肾N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达 | 第42页 |
| 2.6.鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达 | 第42页 |
| 2.7.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶活性测定 | 第42-45页 |
| 3.结果与讨论 | 第45-53页 |
| 3.1.猪肾N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达 | 第45-46页 |
| 3.2.鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达 | 第46-47页 |
| 3.3.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶活性测定 | 第47-52页 |
| 3.4.猪肾AGE与鱼腥藻AGE表达产量比较 | 第52-53页 |
| 4.结论 | 第53-54页 |
| 第4章 双酶法制备N-乙酰神经氨酸的研究 | 第54-68页 |
| 1.材料 | 第54-55页 |
| 1.1.试剂 | 第54页 |
| 1.2.培养基 | 第54页 |
| 1.3.菌种与质粒 | 第54-55页 |
| 2.方法 | 第55-59页 |
| 2.1.Neu5Ac的HPLC检测 | 第55-56页 |
| 2.2.NAL酶活测定 | 第56页 |
| 2.3.AGE酶活测定 | 第56页 |
| 2.4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第56-57页 |
| 2.5.产酶基因工程菌的诱导表达 | 第57页 |
| 2.6.粗酶液制备 | 第57页 |
| 2.7.NAL与AGE共表达基因工程菌的构建及制备Neu5Ac实验 | 第57-58页 |
| 2.8.单独表达AGE和NAL制备Neu5Ac | 第58-59页 |
| 2.9.全细胞转化制备Neu5Ac | 第59页 |
| 3.结果与讨论 | 第59-67页 |
| 3.1.NAL与AGE共表达基因工程菌的构建及Neu5Ac的制备 | 第59-62页 |
| 3.2.单独表达AGE和NAL制备Neu5Ac | 第62-67页 |
| 3.3.全细胞转化 | 第67页 |
| 4.结论 | 第67-68页 |
| 全文总结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-73页 |
| 附录1 猪AGE酶基因测序结果 | 第73-74页 |
| 附录2 鱼腥藻AGE基因测序结果 | 第74-75页 |
| 附录3 N-乙酰神经氨酸质谱检测图 | 第75-76页 |
| 附录4 N-乙酰-D-葡萄糖氨质谱检测 | 第76-77页 |
| 附录5 双酶转化混合物质谱检测图 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
