| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 第一章 前言 | 第18-25页 |
| 1.1 概述 | 第18-19页 |
| 1.2 影响抗菌肽抗菌活性的因素 | 第19-20页 |
| 1.2.1 螺旋度 | 第19页 |
| 1.2.2 疏水性 | 第19-20页 |
| 1.2.3 两亲性 | 第20页 |
| 1.2.4 正电荷数 | 第20页 |
| 1.2.5 特殊氨基酸的作用 | 第20页 |
| 1.3 抗菌肽的改造方法 | 第20-21页 |
| 1.3.1 氨基酸残基替换 | 第20-21页 |
| 1.3.2 截取天然抗菌肽的部分序列 | 第21页 |
| 1.3.3 设计融合肽 | 第21页 |
| 1.3.4 螺旋轮法 | 第21页 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌表达系统的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.5 抗菌肽在饲料中应用研究进展 | 第22-24页 |
| 1.5.1 禽类饲料应用 | 第22-23页 |
| 1.5.2 畜类饲料应用 | 第23页 |
| 1.5.3 水产饲料应用 | 第23-24页 |
| 1.5.4 饲料应用存在的问题 | 第24页 |
| 1.6 实验目的及意义 | 第24-25页 |
| 第2章 东北林蛙皮肤抗菌肽基因的克隆和序列分析 | 第25-39页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 材料 | 第25-28页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第25页 |
| 2.2.2 克隆载体与菌种 | 第25页 |
| 2.2.3 酶与试剂 | 第25页 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 | 第25-26页 |
| 2.2.5 试剂与培养基的配制 | 第26-28页 |
| 2.3 方法 | 第28-32页 |
| 2.3.1 设计东北林蛙抗菌肽通用引物 | 第28页 |
| 2.3.2 提取东北林蛙皮肤总RNA | 第28-29页 |
| 2.3.3 东北林蛙抗菌肽基因的cDNA克隆 | 第29-32页 |
| 2.4 结果 | 第32-38页 |
| 2.4.1 简并引物设计 | 第32-33页 |
| 2.4.2 东北林蛙皮总RNA的提取结果 | 第33页 |
| 2.4.3 抗菌肽的cDNA扩增结果 | 第33-34页 |
| 2.4.4 重组质粒的PCR检测验证 | 第34页 |
| 2.4.5 测序结果及其序列分析 | 第34-37页 |
| 2.4.6 东北林蛙皮成熟抗菌肽的同源分析 | 第37页 |
| 2.4.7 东北林蛙皮抗菌肽成熟肽的结构分析 | 第37-38页 |
| 2.5 讨论 | 第38-39页 |
| 第3章 抗菌肽Dybowskin-2CDYa的表达及功能测定 | 第39-58页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 材料 | 第39-42页 |
| 3.2.1 菌种和载体 | 第39页 |
| 3.2.2 所用试剂与工具酶 | 第39页 |
| 3.2.3 所用设备与仪器 | 第39-40页 |
| 3.2.4 溶液与培养基的配制 | 第40-42页 |
| 3.3 方法 | 第42-50页 |
| 3.3.1 实验思路 | 第42页 |
| 3.3.2 引物设计 | 第42页 |
| 3.3.3 PCR方法扩增Dy2成熟肽序列 | 第42-43页 |
| 3.3.4 Dy2表达质粒的构建及序列分析 | 第43-44页 |
| 3.3.5 制备感受态酵母 | 第44-45页 |
| 3.3.6 线性pPICZα/Dy2转化毕赤酵母GS115 | 第45页 |
| 3.3.7 高拷贝转化子的筛选 | 第45-46页 |
| 3.3.8 酵母转化子的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.3.9 摇瓶水平的表达 | 第47页 |
| 3.3.10 表达产物的检测 | 第47-49页 |
| 3.3.11 测定发酵上清中蛋白含量 | 第49页 |
| 3.3.12 重组蛋白的抑菌活性检测 | 第49-50页 |
| 3.4 结果 | 第50-57页 |
| 3.4.1 Dy2基因序列的获得 | 第50-51页 |
| 3.4.2 PCR筛选阳性重组质粒结果 | 第51页 |
| 3.4.3 阳性重组子测序结果 | 第51页 |
| 3.4.4 重组表达载体pPICZα/ Dy2线性化结果 | 第51-52页 |
| 3.4.5 酵母DNA的提取结果 | 第52页 |
| 3.4.6 酵母转化子的PCR鉴定结果 | 第52页 |
| 3.4.7 阳性转化子RNA提取 | 第52-53页 |
| 3.4.8 酵母mRNA反转录PCR结果 | 第53页 |
| 3.4.9 融合多肽Tricine-SDS-PAGE分析结果 | 第53-54页 |
| 3.4.10 发酵上清液液相色谱检测结果 | 第54-55页 |
| 3.4.11 发酵上清液中蛋白含量的测定 | 第55页 |
| 3.4.12 表达产物抑菌活性检测 | 第55-57页 |
| 3.5 讨论 | 第57-58页 |
| 第4章 抗菌肽Dy2的优化与表达研究 | 第58-69页 |
| 4.1 引言 | 第58页 |
| 4.2 研究材料 | 第58-59页 |
| 4.2.1 菌种和载体 | 第58页 |
| 4.2.2 工具酶与生化试剂 | 第58-59页 |
| 4.2.3 生物软件 | 第59页 |
| 4.2.4 主要仪器和设备 | 第59页 |
| 4.2.5 溶液与培养基的配置 | 第59页 |
| 4.3 方法 | 第59-62页 |
| 4.3.1 抗菌肽Dy2及RK6的理化性质及结构预测 | 第59-60页 |
| 4.3.2 RK6表达载体设计策略 | 第60页 |
| 4.3.3 引物设计 | 第60页 |
| 4.3.4 RK6序列扩增 | 第60-61页 |
| 4.3.5 RK6表达载体的构建 | 第61页 |
| 4.3.6 RK6的表达 | 第61页 |
| 4.3.7 RK6的纯化及活性检测 | 第61页 |
| 4.3.8 RK6与Dy2抑菌活性对比 | 第61页 |
| 4.3.9 RK6与Dy2溶血性对比 | 第61-62页 |
| 4.3.10 RK6与Dy2稳定性对比 | 第62页 |
| 4.4 结果 | 第62-67页 |
| 4.4.1 理化性质预测结果 | 第62-63页 |
| 4.4.2 HNN法预测二级结构结果 | 第63页 |
| 4.4.3 ArgusLab4.0模拟二级结构 | 第63-64页 |
| 4.4.4 两亲性预测结果 | 第64-65页 |
| 4.4.5 RK6的纯化结果 | 第65-66页 |
| 4.4.6 抑菌活性鉴定 | 第66页 |
| 4.4.7 Dy2和RK6抑菌活性对比 | 第66页 |
| 4.4.8 RK6与Dy2溶血性对比 | 第66页 |
| 4.4.9 RK6与Dy2热稳定性对比 | 第66-67页 |
| 4.5 讨论 | 第67-69页 |
| 第5章 重组GST-RK6的表达及在动物饲料中添加的应用研究 | 第69-93页 |
| 5.1 引言 | 第69-70页 |
| 5.2 材料 | 第70-73页 |
| 5.2.1 菌株及载体 | 第70-71页 |
| 5.2.2 实验动物 | 第71页 |
| 5.2.3 实验饲料 | 第71页 |
| 5.2.4 主要仪器和设备 | 第71页 |
| 5.2.5 实验试剂 | 第71-72页 |
| 5.2.6 溶液与培养基的配制 | 第72-73页 |
| 5.3 方法 | 第73-80页 |
| 5.3.1 SacR调控序列的制备 | 第73-74页 |
| 5.3.2 GST标签蛋白序列的制备 | 第74-75页 |
| 5.3.3 RK6抗菌肽序列的制备 | 第75页 |
| 5.3.4 表达元件的制备及与载体的连接 | 第75-77页 |
| 5.3.5 质粒pHY/SGA转化枯草芽孢杆菌WB600 | 第77页 |
| 5.3.6 抗菌肽RK6在WB600中的诱导表达及检测 | 第77-79页 |
| 5.3.7 抑菌活性检测 | 第79页 |
| 5.3.8 雏鸡饲养管理 | 第79-80页 |
| 5.3.9 雏鸡免疫指标检测 | 第80页 |
| 5.3.10 统计分析 | 第80页 |
| 5.4 结果 | 第80-90页 |
| 5.4.1 各元件扩增结果 | 第80-82页 |
| 5.4.2 质粒pHY300PLK酶切结果 | 第82-83页 |
| 5.4.3 测序结果 | 第83页 |
| 5.4.4 重组蛋白GST-RK6在WB600中的诱导表达结果 | 第83-84页 |
| 5.4.5 Western-Blot结果图 | 第84-85页 |
| 5.4.6 抑菌活性检测结果 | 第85页 |
| 5.4.7 雏鸡平均体重 | 第85-87页 |
| 5.4.8 雏鸡免疫器官指数 | 第87页 |
| 5.4.9 雏鸡血清免疫指标 | 第87-90页 |
| 5.5 讨论 | 第90-93页 |
| 第6章 结论与展望 | 第93-94页 |
| 6.1 结论 | 第93页 |
| 6.2 展望 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-102页 |
| 附录 | 第102-107页 |
| 攻读学位论文期间发表文章 | 第107-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
