| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第10-15页 |
| 1.1 疱疹病毒概述 | 第10页 |
| 1.2 疱疹病毒的生物学特征 | 第10页 |
| 1.2.1 病毒分类 | 第10页 |
| 1.2.2 病毒形态结构 | 第10页 |
| 1.3 疱疹病毒基因组结构的研究 | 第10-12页 |
| 1.3.1 主要囊膜糖蛋白 | 第11页 |
| 1.3.2 皮层蛋白和衣壳蛋白 | 第11-12页 |
| 1.3.3 重复区内的基因 | 第12页 |
| 1.4 病毒复制 | 第12页 |
| 1.5 流行病学 | 第12页 |
| 1.6 DNA疫苗研究进展 | 第12-13页 |
| 1.7 免疫佐剂研究进展 | 第13页 |
| 1.7.1 免疫佐剂作用机理 | 第13页 |
| 1.7.2 常见免疫佐剂 | 第13页 |
| 1.8 研究的目的及意义 | 第13-15页 |
| 2 研究的主要内容 | 第15-31页 |
| 2.1 试验材料 | 第15-17页 |
| 2.1.1 病毒来源 | 第15页 |
| 2.1.2 实验动物 | 第15页 |
| 2.1.3 质粒、菌株及阳性血清 | 第15页 |
| 2.1.4 原代鸡胚成纤维细胞制备及培养 | 第15页 |
| 2.1.5 主要试剂 | 第15-16页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第16-17页 |
| 2.2 鸽疱疹病毒全基因组的克隆 | 第17-24页 |
| 2.2.1 病毒的增殖 | 第17页 |
| 2.2.2 病毒滴度检测 | 第17页 |
| 2.2.3 基因组DNA的提取及鉴定 | 第17-18页 |
| 2.2.4 间接免疫荧光检测 | 第18页 |
| 2.2.5 引物设计与合成 | 第18-20页 |
| 2.2.6 基因组的分段克隆 | 第20页 |
| 2.2.7 单引物扩增确定TR_L/U_L和U_L/IR_L接头 | 第20-22页 |
| 2.2.8 单引物扩增确定IR_S/U_S和U_S/TR_S接头 | 第22页 |
| 2.2.9 PCR产物鉴定及回收纯化 | 第22页 |
| 2.2.10 PCR产物连接与转化 | 第22-23页 |
| 2.2.11 重组质粒的提取、鉴定及序列分析测定 | 第23页 |
| 2.2.12 全基因组序列拼接及分析 | 第23-24页 |
| 2.3 鸽疱疹病毒DNA疫苗的制备 | 第24-28页 |
| 2.3.1 编码囊膜蛋白gC、gD和gE的基因克隆及分析测定 | 第24-25页 |
| 2.3.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒的大量抽提和浓度测定 | 第25-26页 |
| 2.3.3 重组真核表达载体pgC、pgD和pgE的构建 | 第26-27页 |
| 2.3.4 重组质粒的小量提取、鉴定及测序 | 第27页 |
| 2.3.5 重组质粒的大量提取及浓度测定 | 第27页 |
| 2.3.6 重组真核表达质粒在CEF中的瞬时表达 | 第27-28页 |
| 2.3.7 鸽疱疹病毒的灭活 | 第28页 |
| 2.4 动物实验 | 第28-30页 |
| 2.4.1 免疫及分组 | 第28页 |
| 2.4.2 免疫后样品的采集 | 第28-29页 |
| 2.4.3 Real-time RT-PCR检测外周淋巴细胞中细胞因子表达水平 | 第29页 |
| 2.4.4 中和抗体检测 | 第29页 |
| 2.4.5 间接ELISA法检测血清中抗体水平 | 第29-30页 |
| 2.4.6 攻毒后保护力评价 | 第30页 |
| 2.5 统计学分析 | 第30-31页 |
| 3 实验结果 | 第31-53页 |
| 3.1 病毒增殖及滴度检测结果 | 第31页 |
| 3.2 病毒基因组DNA鉴定结果 | 第31-32页 |
| 3.3 间接免疫荧光检测结果 | 第32页 |
| 3.4 基因组序列分段扩增结果 | 第32-34页 |
| 3.5 TR_L/U_L和U_L/IR_L接头的确定 | 第34-35页 |
| 3.6 IR_S/U_S和U_S/TR_S接头的确定 | 第35-36页 |
| 3.7 鸽疱疹病毒基因组结构组成 | 第36页 |
| 3.8 遗传进化分析 | 第36-38页 |
| 3.9 开放阅读框分析 | 第38-41页 |
| 3.10 单核苷酸多态性分析 | 第41-45页 |
| 3.11 gC(U_L44)、gD(U_S6)和gE(U_S8)基因克隆结果 | 第45-46页 |
| 3.12 重组质粒鉴定结果 | 第46-47页 |
| 3.12.1 重组质粒PCR鉴定结果 | 第46页 |
| 3.12.2 重组质粒酶切鉴定结果 | 第46-47页 |
| 3.13 重组质粒浓度测定 | 第47页 |
| 3.14 重组质粒在真核细胞中表达的检测 | 第47-49页 |
| 3.14.1 转染后的PCR检测结果 | 第47-48页 |
| 3.14.2 瞬时表达产物的荧光检测结果 | 第48-49页 |
| 3.15 Real-time RT-PCR检测外周血淋巴细胞中细胞因子表达水平 | 第49-50页 |
| 3.16 中和抗体检测结果 | 第50页 |
| 3.17 间接ELISA法检测血清抗体水平 | 第50-51页 |
| 3.18 攻毒后保护力评价 | 第51-53页 |
| 3.18.1 攻毒后保护率检测试验结果 | 第51-52页 |
| 3.18.2 攻毒后病理学观察结果 | 第52-53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 4.1 鸽疱疹病毒基因特点 | 第53页 |
| 4.2 鸽疱疹病毒进化地位 | 第53-54页 |
| 4.3 鸽疱疹病毒TR_L/U_L和U_L/IR_L接头及IR_S/U_S和U_S/TR_S接头克隆 | 第54页 |
| 4.4 鸽疱疹病毒的DNA疫苗效果评价 | 第54-56页 |
| 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-65页 |
| 附录 | 第65-67页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
