| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第一章 引言 | 第16-23页 |
| 1.1 文献综述 | 第16-22页 |
| 1.1.1 斑节对虾简介 | 第16页 |
| 1.1.2 斑节对虾卵巢发育研究现状 | 第16-17页 |
| 1.1.3 斑节对虾卵巢发育相关基因的研究现状 | 第17-18页 |
| 1.1.4 成视网膜细胞瘤基因（Rb）基因的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.1.5 检验点激酶 1（Chk1）基因的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.2 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 斑节对虾RBL基因的克隆及功能分析 | 第23-58页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-26页 |
| 2.2.1 实验动物 | 第23页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第23-25页 |
| 2.2.3 实验试剂与配制 | 第25-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-39页 |
| 2.3.1 实验用品预处理 | 第26页 |
| 2.3.2 总RNA提取和cDNA的合成 | 第26-28页 |
| 2.3.3 PmRBL基因cDNA全长的克隆 | 第28-34页 |
| 2.3.3.1 开放阅读框的预测 | 第28页 |
| 2.3.3.2 引物的设计 | 第28-29页 |
| 2.3.3.3 PCR产物切胶回收 | 第29-30页 |
| 2.3.3.4 PCR产物连接和转化 | 第30-31页 |
| 2.3.3.5 挑取单克隆和菌液检测 | 第31页 |
| 2.3.3.6 RACE克隆基因 3'非编码区 | 第31-34页 |
| 2.3.4 PmRBL基因定量表达分析 | 第34-35页 |
| 2.3.5 PmRBL基因双链RNA干扰实验 | 第35-38页 |
| 2.3.5.1 构建pD7-RBL和pD7-GFP重组载体 | 第35-36页 |
| 2.3.5.2 制备体外转录模板 | 第36-37页 |
| 2.3.5.3 双链RNA的体外转录及纯化 | 第37页 |
| 2.3.5.4 双链RNA的精制 | 第37-38页 |
| 2.3.5.5 dsRNA-RBL注射实验 | 第38页 |
| 2.3.6 RBL原位杂交试验 | 第38-39页 |
| 2.3.7 性腺指数（GSI）试验 | 第39页 |
| 2.3.8 序列分析与系统进化树的构建 | 第39页 |
| 2.4 实验结果 | 第39-55页 |
| 2.4.1 PmRBL生物信息学分 | 第39-46页 |
| 2.4.1.1 PmRBL的cDNA序列特征 | 第39-43页 |
| 2.4.1.2 PmRBL多重序列比对和系统进化树分析 | 第43-46页 |
| 2.4.2 PmRBL基因在不同组织及卵巢发育各期的表达分析 | 第46-48页 |
| 2.4.2.1 PmRBL mRNA在不同组织中的表达分析 | 第46-47页 |
| 2.4.2.2 PmRBL mRNA在卵巢发育各期的表达分析 | 第47-48页 |
| 2.4.3 PmRBL基因在 5-HT刺激和眼柄切除后卵巢中的表达分析 | 第48-49页 |
| 2.4.3.1 PmRBL基因在 5-HT刺激后卵巢中的表达分析 | 第48-49页 |
| 2.4.3.2 PmRBL基因在眼柄切除后卵巢中的表达分析 | 第49页 |
| 2.4.4 靶向沉默RBL相关基因的表达分析、原位杂交及性腺指数检测 | 第49-55页 |
| 2.4.4.1 PmRBL mRNA在dsRNA-p53干扰之后的表达分析 | 第49-50页 |
| 2.4.4.2 PmRBL mRNA在dsRNA-RBL干扰之后的表达分析 | 第50-51页 |
| 2.4.4.3 PmCDC2和PmCyclin B在dsRNA-RBL后的表达分析 | 第51-53页 |
| 2.4.4.4 原位杂交检测PmRBL的表达分析 | 第53-54页 |
| 2.4.4.5 性腺指数检测卵巢发育 | 第54-55页 |
| 2.5 讨论 | 第55-58页 |
| 第三章 斑节对虾CHK1基因的克隆及功能分析 | 第58-97页 |
| 3.1 引言 | 第58页 |
| 3.2 实验材料 | 第58-60页 |
| 3.2.1 实验动物 | 第58页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第58页 |
| 3.2.3 实验试剂与配制 | 第58-60页 |
| 3.3 实验方法 | 第60-75页 |
| 3.3.1 实验用品预处理 | 第60页 |
| 3.3.2 总RNA提取和cDNA的合成 | 第60页 |
| 3.3.3 Chk1基因cDNA全长的克隆 | 第60-63页 |
| 3.3.3.1 开放阅读框的预测 | 第60页 |
| 3.3.3.2 引物的设计 | 第60-62页 |
| 3.3.3.3 PCR产物切胶回收 | 第62页 |
| 3.3.3.4 PCR产物连接和转化 | 第62页 |
| 3.3.3.5 挑取单克隆和菌液检测 | 第62页 |
| 3.3.3.6 RACE克隆基因 3'非编码区 | 第62-63页 |
| 3.3.4 Chk1基因组DNA全长的克隆 | 第63-67页 |
| 3.3.4.1 DNA提取 | 第63-64页 |
| 3.3.4.2 Chk1基因内含子的扩增 | 第64页 |
| 3.3.4.3 扩增Chk1基因 5’上游基因 | 第64-67页 |
| 3.3.5 PmChk1基因定量表达分析 | 第67-68页 |
| 3.3.6 PmChk1基因双链RNA干扰实验 | 第68页 |
| 3.3.6.1 构建pD7-Chk1和pD7-GFP重组载体 | 第68页 |
| 3.3.6.2 制备体外转录模板 | 第68页 |
| 3.3.6.3 双链RNA的体外转录及纯化 | 第68页 |
| 3.3.6.4 双链RNA的精制 | 第68页 |
| 3.3.6.5 dsRNA-Chk1注射实验 | 第68页 |
| 3.3.7 Chk1原位杂交试验 | 第68页 |
| 3.3.8 性腺指数（GSI）试验 | 第68-69页 |
| 3.3.9 序列分析与系统进化树的构建 | 第69页 |
| 3.3.10 PmChk1基因的体外重组、蛋白纯化及抗体制备 | 第69-72页 |
| 3.3.10.1 PmChk1-pET-30a-c(+)重组载体的构建 | 第69-70页 |
| 3.3.10.2 PmChk1-pET-30a-c(+)重组质粒诱导表达 | 第70页 |
| 3.3.10.3SDS-PAGE检测 | 第70-71页 |
| 3.3.10.4 蛋白免疫印迹（Western Blotting） | 第71页 |
| 3.3.10.5 蛋白的纯化和抗体制备 | 第71-72页 |
| 3.3.11 注射dsRNA-Chk1后斑节对虾卵巢蛋白蛋白免疫印迹和组织酶活检测 | 第72-74页 |
| 3.3.11.1 卵巢组织蛋白的提取 | 第72页 |
| 3.3.11.2 蛋白浓度的测定 | 第72页 |
| 3.3.11.3 蛋白免疫印迹（Western Blotting） | 第72-73页 |
| 3.3.11.4 组织Chk1激酶活性检测 | 第73-74页 |
| 3.3.12 数据分析 | 第74-75页 |
| 3.4 实验结果 | 第75-93页 |
| 3.4.1 PmChk1生物信息学分析 | 第75-81页 |
| 3.4.1.1 PmChk1的cDNA序列特征 | 第75-77页 |
| 3.4.1.2 PmChk1基因组结构和上游调节元件 | 第77-79页 |
| 3.4.1.3 PmChk1多重序列比对和系统进化树分析 | 第79-81页 |
| 3.4.2 PmChk1在组织、卵巢发育各期及个体发育各期的表达分析 | 第81-83页 |
| 3.4.2.1 PmChk1 mRNA在不同组织中的表达分析 | 第81页 |
| 3.4.2.2 PmChk1 mRNA在卵巢发育各期的表达分析 | 第81-82页 |
| 3.4.2.3 PmChk1 mRNA在个体发育各期的表达分析 | 第82-83页 |
| 3.4.3 PmChk1在 5-HT和DA刺激和眼柄切除后卵巢中的表达分析 | 第83-84页 |
| 3.4.3.1 PmChk1基因在 5-HT和DA刺激后卵巢中的表达分析 | 第83-84页 |
| 3.4.3.2 PmChk1基因在眼柄切除后卵巢中的表达分析 | 第84页 |
| 3.4.4 靶向沉默Chk1相关基因的表达分析、原位杂交、性腺指数及酶活的检测 | 第84-92页 |
| 3.4.4.1 PmChk1 mRNA在dsRNA-p53干扰之后的表达分析 | 第84-85页 |
| 3.4.4.2 PmChk1 mRNA在dsRNA-RBL干扰之后的表达分析 | 第85-86页 |
| 3.4.4.3 PmChk1 mRNA在dsRNA-Chk1干扰之后的表达分析 | 第86-87页 |
| 3.4.4.4 PmCDC2和PmCyclin B在dsRNA-Chk1后的表达分析 | 第87-89页 |
| 3.4.4.5 原位杂交检测PmChk1的表达分析 | 第89-90页 |
| 3.4.4.6 性腺指数检测卵巢发育 | 第90-91页 |
| 3.4.4.7 Chk1酶活检测 | 第91-92页 |
| 3.4.5 PmChk1的体外重组、纯化、抗体制备及免疫印迹 | 第92-93页 |
| 3.4.5.1 PmChk1的体外重组、纯化及抗体制备 | 第92页 |
| 3.4.5.2 注射dsRNA-Chk1后卵巢组织蛋白免疫印迹 | 第92-93页 |
| 3.5 讨论 | 第93-97页 |
| 结论 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-108页 |
| 附录 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109页 |
