| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第7-15页 |
| 1.1 反式4羟脯氨酸简介 | 第7-10页 |
| 1.1.1 Hyp的应用 | 第7-8页 |
| 1.1.2 微生物酶法生产Hyp | 第8-10页 |
| 1.2 产Hyp重组大肠杆菌的改造策略 | 第10-13页 |
| 1.2.1 putA基因 | 第10页 |
| 1.2.2 vgb基因 | 第10-11页 |
| 1.2.3 sucA基因 | 第11页 |
| 1.2.4 Red同源重组系统 | 第11-13页 |
| 1.3 研究进展 | 第13-14页 |
| 1.4 课题研究意义与研究内容 | 第14-15页 |
| 第二章 材料与方法 | 第15-26页 |
| 2.1 材料 | 第15-18页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第15页 |
| 2.1.2 主要的酶与试剂 | 第15-16页 |
| 2.1.3 主要实验仪器 | 第16页 |
| 2.1.4 实验所用引物 | 第16-17页 |
| 2.1.5 培养基 | 第17页 |
| 2.1.6 主要溶液 | 第17-18页 |
| 2.2 实验方法 | 第18-23页 |
| 2.2.1 含有打靶片段载体的构建 | 第18-20页 |
| 2.2.2 大肠杆菌sucA基因敲除菌的构建 | 第20-21页 |
| 2.2.3 高产Hyp菌株的筛选 | 第21页 |
| 2.2.4 重组大肠杆菌的培养 | 第21-22页 |
| 2.2.5 摇瓶发酵优化 | 第22-23页 |
| 2.3 分析方法 | 第23-26页 |
| 2.3.1 全细胞酶活测定 | 第23页 |
| 2.3.2 发酵液中Hyp含量的测定 | 第23-24页 |
| 2.3.3 发酵液中L-脯氨酸含量的测定 | 第24页 |
| 2.3.4 发酵液中葡萄糖含量的测定 | 第24-26页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第26-44页 |
| 3.1 大肠杆菌sucA敲除菌株构建 | 第26-29页 |
| 3.1.1 基因sucA的上下游同源臂与kan抗性基因片段的获得 | 第26页 |
| 3.1.2 融合片段的获得 | 第26-27页 |
| 3.1.3 打靶片段的获得 | 第27-28页 |
| 3.1.4 sucA敲除菌株构建 | 第28-29页 |
| 3.2 高产Hyp菌株的筛选 | 第29-32页 |
| 3.2.1 vgb基因对Hyp产量的影响 | 第29页 |
| 3.2.2 高产Hyp sucA敲除菌株的筛选 | 第29-31页 |
| 3.2.3 全细胞酶活的测定 | 第31-32页 |
| 3.3 E.coli BL21(DE3)ΔputAΔsucA/pUHVT4的摇瓶发酵优化 | 第32-40页 |
| 3.3.1 生长曲线与发酵曲线测定 | 第32页 |
| 3.3.2 单因素摇瓶发酵优化 | 第32-37页 |
| 3.3.3 正交实验及结果分析 | 第37-38页 |
| 3.3.4 发酵培养基的进一步优化 | 第38-39页 |
| 3.3.5 发酵验证 | 第39-40页 |
| 3.4 5L发酵罐补料分批发酵 | 第40-44页 |
| 3.4.1 1.6 g·L~(-1)·h~(-1)补糖速度实验 | 第40-41页 |
| 3.4.2 1.8 g·L~(-1)·h~(-1)补糖速度实验 | 第41-42页 |
| 3.4.3 2.0 g·L~(-1)·h~(-1)补糖速度实验 | 第42-43页 |
| 3.4.4 发酵培养基组分的调整 | 第43-44页 |
| 主要结论与展望 | 第44-45页 |
| 致谢 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-50页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第50页 |
