| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-17页 |
| 前言 | 第17-21页 |
| 第一章 低温胁迫对播娘蒿DsCOR基因表达的影响 | 第21-35页 |
| 1.材料和方法 | 第21-26页 |
| ·材料 | 第21-22页 |
| ·植物来源 | 第21页 |
| ·菌种 | 第21页 |
| ·实验用试剂盒、工具酶和其它试剂 | 第21页 |
| ·仪器 | 第21-22页 |
| ·引物合成 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-26页 |
| ·植株的培养 | 第22页 |
| ·播娘蒿的冷胁迫处理 | 第22页 |
| ·播娘蒿总RNA的提取 | 第22-23页 |
| ·总RNA质量的检测 | 第23页 |
| ·反转录反应合成cDNA | 第23-24页 |
| ·内参基因的选择 | 第24页 |
| ·PCR扩增18S rRNA片段 | 第24-25页 |
| ·用于半定量RT-PCR的引物的设计 | 第25页 |
| ·引物的验证 | 第25页 |
| ·半定量RT-PCR | 第25-26页 |
| 2.结果 | 第26-31页 |
| ·总RNA的提取 | 第26页 |
| ·18S rRNA的cDNA片段的克隆 | 第26-27页 |
| ·引物参数 | 第27页 |
| ·半定量RT-PCR引物的验证 | 第27-28页 |
| ·半定量RT-PCR | 第28-31页 |
| 3.讨论 | 第31-35页 |
| ·内标的选择 | 第31页 |
| ·循环数的确定 | 第31-32页 |
| ·低温胁迫对播娘蒿DsCOR基因的影响 | 第32-34页 |
| ·总RNA的提取 | 第34-35页 |
| 第二章 播娘蒿DsCOR基因的原核表达以及蛋白纯化体系的建立 | 第35-60页 |
| 1 材料与方法 | 第35-51页 |
| ·材料 | 第35-38页 |
| ·菌种 | 第35页 |
| ·载体 | 第35页 |
| ·酶制剂 | 第35页 |
| ·试剂盒 | 第35-36页 |
| ·主要试剂及试剂配方 | 第36-37页 |
| ·仪器 | 第37-38页 |
| ·引物及测序 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-51页 |
| ·播娘蒿的总RNA的提取 | 第38页 |
| ·反转录PCR | 第38页 |
| ·播娘蒿DsCOR基因ORF的克隆 | 第38-40页 |
| ·TA克隆和测序 | 第40页 |
| ·原核表达载体pET32a-DsCOR的构建 | 第40-41页 |
| ·大肠杆菌CaCl_2法感受态细胞的制备及转化 | 第41-43页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第43-45页 |
| ·融合蛋白表达条件的优化 | 第45页 |
| ·煮沸-镍离子亲和层析法纯化蛋白及SDS-PAGE电泳检测 | 第45-47页 |
| ·透析袋电洗脱法纯化蛋白及SDS-PAGE电泳检测 | 第47-50页 |
| ·目的蛋白的浓缩或冻干 | 第50页 |
| ·目的蛋白浓度的测定 | 第50-51页 |
| 2 结果和分析 | 第51-55页 |
| ·播娘蒿总RNA的质量检测 | 第51页 |
| ·表达载体pET32a—DsCOR的构建的结果 | 第51页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第51-52页 |
| ·融合蛋白表达条件的优化 | 第52-53页 |
| ·煮沸-镍离子亲和层析法纯化蛋白 | 第53-54页 |
| ·透析袋电洗脱法纯化蛋白 | 第54-55页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第55页 |
| ·BSA标准曲线的建立 | 第55页 |
| ·样品中蛋白质含量的测定 | 第55页 |
| 3.讨论 | 第55-60页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白的生物信息学分析及蛋白纯化方法的确立 | 第55-56页 |
| ·播娘蒿DsCOR表达载体与受体菌的选择 | 第56-57页 |
| ·SDS—PAGE蛋白质凝胶电泳 | 第57-58页 |
| ·透析袋电洗脱法纯化DsCOR蛋白 | 第58-60页 |
| 第三章 播娘蒿DsCOR蛋白生理性质以及表达规律的研究 | 第60-74页 |
| 1 材料与方法 | 第60-66页 |
| ·材料 | 第60-63页 |
| ·动物 | 第60页 |
| ·试剂及试剂配方 | 第60-63页 |
| ·材料与仪器 | 第63页 |
| ·方法 | 第63-66页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白生理性质的研究 | 第63-64页 |
| ·抗原制备 | 第64页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第64-65页 |
| ·间接ELISA法测定效价 | 第65页 |
| ·播娘蒿叶片蛋白的提取 | 第65-66页 |
| ·Western bloting | 第66页 |
| 2 结果与分析 | 第66-71页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白生理性质的研究 | 第66-68页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白高温耐受性测定结果 | 第66-67页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白酸碱耐受范围测定结果 | 第67-68页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白紫外耐受性测定结果 | 第68页 |
| ·免疫血清的效价测定 | 第68-69页 |
| ·Western bloting结果 | 第69-71页 |
| ·重组蛋白的Western bloting | 第69-70页 |
| ·播娘蒿天然植物蛋白的Western bloting | 第70-71页 |
| 3 讨论 | 第71-74页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白抗体的效价测定 | 第71-72页 |
| ·播娘蒿DsCOR蛋白性质分析 | 第72-74页 |
| 第四章 播娘蒿DsCOR基因根癌农杆菌表达载体的构建及转化拟南芥 | 第74-81页 |
| 1 材料和方法 | 第74-77页 |
| ·材料 | 第74-75页 |
| ·菌株和载体 | 第74页 |
| ·酶与试剂盒 | 第74页 |
| ·实验器材 | 第74-75页 |
| ·方法 | 第75-77页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA2301G-DsCOR的构建 | 第75-76页 |
| ·用PCR方法检测连接子 | 第76页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第76-77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-78页 |
| ·载体pCAMBIA2301G-DsCOR的构建结果 | 第77页 |
| ·根癌农杆菌的转化 | 第77-78页 |
| 3.讨论 | 第78-81页 |
| ·植物表达载体的选用 | 第78-79页 |
| ·大肠杆菌转化效率的提高 | 第79-81页 |
| 第五章 花序浸染法转化拟南芥Cor15a基因缺失突变株以及转基因拟南芥的筛选鉴定与功能分析 | 第81-99页 |
| 1.材料和方法 | 第81-88页 |
| ·材料 | 第81-84页 |
| ·植物材料 | 第81页 |
| ·菌株 | 第81页 |
| ·主要试剂及试剂配方 | 第81-83页 |
| ·试剂盒 | 第83-84页 |
| ·实验器材 | 第84页 |
| ·引物 | 第84页 |
| ·方法 | 第84-88页 |
| ·拟南芥的种植 | 第84-85页 |
| ·农杆菌浸染液的培养 | 第85页 |
| ·花序浸染法转化拟南芥PST15781 | 第85页 |
| ·用抗性选择标记选择转化子 | 第85-86页 |
| ·再生植株的移栽 | 第86-87页 |
| ·植物基因总DNA的提取 | 第87页 |
| ·PCR法检测阳性苗 | 第87-88页 |
| ·拟南芥的低温胁迫处理 | 第88页 |
| 2.结果 | 第88-96页 |
| ·拟南芥的生长过程以及花序浸染 | 第88-90页 |
| ·花序浸染法转化拟南芥 | 第90-92页 |
| ·用卡那霉素抗性筛选培养基筛选得到抗性转基因植株 | 第92页 |
| ·抗性植株的移栽 | 第92-93页 |
| ·转基因植株的PCR法检测 | 第93-95页 |
| ·转基因拟南芥的表型分析 | 第95-96页 |
| 3 讨论 | 第96-99页 |
| ·转DsCOR基因拟南芥的功能分析 | 第96-97页 |
| ·花序浸染法的优缺点和应用 | 第97页 |
| ·转基因植物的PCR检测 | 第97-99页 |
| 结论 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 综述 | 第101-122页 |
| 1、低温对植物造成损伤的机制 | 第102-105页 |
| ·"膜脂相变冷害"假说 | 第102-103页 |
| ·植物内部结冰 | 第103-104页 |
| ·冰冻-融化胁迫引起的膜伤害 | 第104页 |
| ·低温导致的氧化胁迫 | 第104页 |
| ·六角形II相脂 | 第104-105页 |
| 2、冷驯化可以提高植物的抗寒性 | 第105-109页 |
| 3、评价植物抗寒性强弱的指标 | 第109-111页 |
| ·酶活力 | 第109页 |
| ·游离氨基酸水平 | 第109-110页 |
| ·可溶性多糖含量 | 第110页 |
| ·多胺含量 | 第110页 |
| ·花青素含量 | 第110页 |
| ·电导率 | 第110-111页 |
| ·半致死温度 | 第111页 |
| 4、蛋白质的变化与植物抗寒性的关系 | 第111-113页 |
| ·冷驯化过程中植物内可溶性蛋白含量的变化 | 第111-112页 |
| ·植物在冷驯化过程中诱导产生新的特异性蛋白 | 第112-113页 |
| 5、受冷诱导的转录促进因子家族-CBF | 第113-118页 |
| ·CBF的发现及其作用机制 | 第113-117页 |
| ·CBF4的发现以及CBF在植物抗旱中的作用 | 第117-118页 |
| 6、植物冷诱导基因COR(cold-regulated gene) | 第118-119页 |
| 7、播娘蒿抗寒相关研究 | 第119-122页 |
| 参考文献 | 第122-128页 |
