| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-39页 |
| 1.1 FLCN研究进展 | 第16-23页 |
| 1.1.1 FLCN的结构 | 第16-18页 |
| 1.1.2 FLCN的功能 | 第18-19页 |
| 1.1.3 FLCN在mTORC1信号通路中的作用 | 第19-22页 |
| 1.1.4 FLCN在囊泡运输中的潜在功能 | 第22-23页 |
| 1.2 氨基酸转运蛋白PAT1研究进展 | 第23-29页 |
| 1.2.1 PAT1的结构 | 第24-25页 |
| 1.2.2 PAT1在细胞内的定位 | 第25-27页 |
| 1.2.3 PAT1在mTORC1信号通路中的作用 | 第27-29页 |
| 1.3 Rab蛋白与囊泡运输 | 第29-33页 |
| 1.3.1 Rab蛋白家族 | 第29-30页 |
| 1.3.2 Rab蛋白活性的调控 | 第30-31页 |
| 1.3.3 Rab蛋白在囊泡运输中的功能 | 第31-33页 |
| 1.4 Rab11研究进展 | 第33-37页 |
| 1.4.1 Rab11蛋白家族 | 第33-34页 |
| 1.4.2 Rab11活性调节蛋白 | 第34-35页 |
| 1.4.3 Rab11的效应因子 | 第35-36页 |
| 1.4.4 Rab11在囊泡运输中的功能 | 第36-37页 |
| 1.5 前期研究发现及本研究设想 | 第37-39页 |
| 1.5.1 前期研究发现 | 第37-38页 |
| 1.5.2 本研究设想 | 第38-39页 |
| 第二章 PAT1在HEK293细胞内的定位及运输途径 | 第39-55页 |
| 2.1 材料 | 第39-41页 |
| 2.1.1 细胞、载体和抗体 | 第39-40页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第40页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第40-41页 |
| 2.2 实验方法 | 第41-48页 |
| 2.2.1 构建真核表达载体 | 第41-44页 |
| 2.2.2 稳定表达PAT1-3×FLAG细胞株的构建 | 第44-46页 |
| 2.2.3 细胞免疫荧光染色检测myc-PAT1的表达定位 | 第46-48页 |
| 2.3 结果与分析 | 第48-53页 |
| 2.3.1 重组质粒的酶切鉴定 | 第48-49页 |
| 2.3.2 稳定表达PAT1-3×FLAG细胞株的Westernblot鉴定 | 第49页 |
| 2.3.3 myc-PAT1与mCherry融合的不同囊泡标记蛋白的共定位 | 第49-51页 |
| 2.3.4 myc-PAT1与内源囊泡标记蛋白的共定位 | 第51-52页 |
| 2.3.5 myc-PAT1与TGN38、M6PR、EEA1以及Chmp5蛋白的共定位 | 第52-53页 |
| 2.3.6 PAT1-3×FLAG的间接运输途径 | 第53页 |
| 2.4 讨论 | 第53-54页 |
| 2.5 小结 | 第54-55页 |
| 第三章 FLCN对PAT1在细胞内分布的影响 | 第55-69页 |
| 3.1 材料 | 第55-56页 |
| 3.1.1 细胞、载体和抗体 | 第55页 |
| 3.1.2 siRNA序列 | 第55-56页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第56页 |
| 3.2 实验方法 | 第56-61页 |
| 3.2.1 FLCN对PAT1溶酶体定位的影响 | 第56-57页 |
| 3.2.2 FLCN对PAT1细胞膜定位的影响 | 第57-58页 |
| 3.2.3 细胞免疫荧光检测FLCN对PAT1胞内定位的影响 | 第58页 |
| 3.2.4 FLCN对PAT1调控mTORC1活性的影响 | 第58-59页 |
| 3.2.5 荧光定量PCR检测PAT1siRNA的干扰效率 | 第59-61页 |
| 3.3 结果与分析 | 第61-67页 |
| 3.3.1 抑制FLCN对PAT1-3×FLAG溶酶体定位的影响 | 第61-62页 |
| 3.3.2 抑制FLCN对PAT1-3×FLAG细胞膜定位的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.3 细胞免疫荧光检测FLCN对PAT1细胞内定位的影响 | 第63页 |
| 3.3.4 敲除FLCN对PAT1-3×FLAG溶酶体定位的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.5 敲除FLCN对PAT1-3×FLAG细胞膜定位的影响 | 第64-65页 |
| 3.3.6 FLCN在PAT1过表达条件下对mTORC1的影响 | 第65-66页 |
| 3.3.7 FLCN在抑制PAT1条件下对mTORC1的影响 | 第66-67页 |
| 3.4 讨论 | 第67-68页 |
| 3.5 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 FLCN与Rab11A存在蛋白与蛋白间相互作用 | 第69-79页 |
| 4.1 材料 | 第69-70页 |
| 4.1.1 细胞、载体和抗体 | 第69页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第69-70页 |
| 4.2 实验方法 | 第70-72页 |
| 4.2.1 FLCN(1-340 AA)和FLCN(341-579 AA)重组质粒的构建 | 第70-71页 |
| 4.2.2 FLCN与Rab5A,Rab7A以及Rab11A的共定位 | 第71页 |
| 4.2.3 蛋白免疫共沉淀(co-IP) | 第71-72页 |
| 4.3 结果与分析 | 第72-77页 |
| 4.3.1 FLCN重组质粒的酶切鉴定结果 | 第72-73页 |
| 4.3.2 FLCN与GFP-Rab5A,GFP-Rab7A以及GFP-Rab11A的共定位分析以及GFP-Rab11A的共定位分析 | 第73页 |
| 4.3.3 FLCN与Rab5A, Rab7A以及Rab11A的co-IP结果 | 第73-74页 |
| 4.3.4 mFLCN与鼠源Rab5A,Rab7A以及Rab11A的co-IP结果 | 第74-75页 |
| 4.3.5 FLCN通过DENN结构域与GFP-Rab11A结合 | 第75-76页 |
| 4.3.6 FLCN可以结合GFP-Rab11B | 第76-77页 |
| 4.4 讨论 | 第77-78页 |
| 4.5 小结 | 第78-79页 |
| 第五章Rab11A调控PAT1在溶酶体和细胞膜上的定位 | 第79-93页 |
| 5.1 材料 | 第79-80页 |
| 5.1.1 细胞、载体和抗体 | 第79页 |
| 5.1.2 Rab11A干扰慢病毒 | 第79-80页 |
| 5.1.3 主要试剂 | 第80页 |
| 5.2 实验方法 | 第80-84页 |
| 5.2.1 Rab11A-CA和Rab11A-DN过表达载体的构建 | 第80-82页 |
| 5.2.2 抑制Rab11A表达对PAT1溶酶体和细胞膜定位的影响 | 第82页 |
| 5.2.3 过表达Rab11A-DN突变体对PAT1溶酶体和细胞膜定位的影响 | 第82-83页 |
| 5.2.4 细胞免疫荧光检测Rab11A对PAT1胞内定位的影响 | 第83页 |
| 5.2.5 抑制Rab11A对PAT1蛋白稳定性的影响 | 第83页 |
| 5.2.6 Rab11A对PAT1调控mTORC1活性的影响 | 第83-84页 |
| 5.3 结果与分析 | 第84-91页 |
| 5.3.1 Rab11A-CA和Rab11A-DN重组质粒的酶切鉴定结果 | 第84-85页 |
| 5.3.2 抑制Rab11A表达促进PAT1在溶酶体上定位 | 第85-86页 |
| 5.3.3 抑制Rab11A表达抑制PAT1在细胞膜定位 | 第86页 |
| 5.3.4 过表达Rab11A-DN(S25N)突变体对PAT1溶酶体定位的影响 | 第86-87页 |
| 5.3.5 过表达Rab11A-DN(S25N)突变体对PAT1细胞膜定位的影响 | 第87-88页 |
| 5.3.6 细胞免疫荧光检测Rab11A对PAT1细胞内定位的影响 | 第88-89页 |
| 5.3.7 抑制Rab11A促进PAT1被溶酶体降解 | 第89-90页 |
| 5.3.8 Rab11A拮抗PAT1抑制mTORC1的作用 | 第90-91页 |
| 5.4 讨论 | 第91-92页 |
| 5.5 小结 | 第92-93页 |
| 第六章FLCN在Rab11A介导的囊泡运输中的功能研究 | 第93-100页 |
| 6.1 材料 | 第93页 |
| 6.1.1 细胞、载体和纯化蛋白 | 第93页 |
| 6.1.2 抗体和试剂 | 第93页 |
| 6.2 实验方法 | 第93-95页 |
| 6.2.1 GEF活性检测实验 | 第93-94页 |
| 6.2.2 Co-IP实验检测FLCN与不同形式Rab11A的结合特异性 | 第94页 |
| 6.2.3 Co-IP实验检测PAT1与Rab5A,Rab7A,Rab11A的结合情况 | 第94页 |
| 6.2.4 Co-IP实验检测FLCN敲除对PAT1-Rab11A相互作用的影响 | 第94页 |
| 6.2.5 Co-IP实验检测FLCN敲除对Tf R-Rab11A相互作用的影响 | 第94-95页 |
| 6.3 结果与分析 | 第95-98页 |
| 6.3.1 FLCN与Rab11A的活性形式结合较为紧密 | 第95-96页 |
| 6.3.2 PAT1-3×FLAG可以结合Rab5A、Rab7A和Rab11A | 第96页 |
| 6.3.3 FLCN特异地影响PAT1与Rab11A的结合 | 第96-97页 |
| 6.3.4 FLCN促进Rab11A与TfR结合 | 第97-98页 |
| 6.4 讨论 | 第98-99页 |
| 6.5 小结 | 第99-100页 |
| 第七章 结论 | 第100-101页 |
| 创新点 | 第101-102页 |
| 下一步研究计划 | 第102-103页 |
| 附录 | 第103-105页 |
| 缩略词 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-120页 |
| 致谢 | 第120-122页 |
| 个人简历 | 第122-123页 |
