| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 缩略词表 | 第14-16页 |
| 第1章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 颗粒前体蛋白Progranulin的结构和功能 | 第16-21页 |
| 1.1.1 Progranulin的结构 | 第16页 |
| 1.1.2 Progranulin的生物学功能 | 第16-21页 |
| 1.2 GLRX3研究进展 | 第21-27页 |
| 1.2.1 GLRX3的结构及在组织中的分布 | 第21-24页 |
| 1.2.2 GLRX3的生物学功能 | 第24-27页 |
| 1.3 表皮生长因子受体(EGFR)在乳腺癌发生发展中的作用 | 第27页 |
| 1.4 课题研究意义 | 第27-28页 |
| 1.5 课题技术路线 | 第28-32页 |
| 1.5.1 GLRX3单克隆抗体的制备 | 第28-29页 |
| 1.5.2 PGRN与GLRX3相互作用的研究 | 第29页 |
| 1.5.3 GLRX3对于PGRN稳定性的研究 | 第29-30页 |
| 1.5.4 功能研究 | 第30-32页 |
| 第2章 针对人GLRX3蛋白的单克隆抗体制备 | 第32-62页 |
| 2.1 实验材料和仪器 | 第32-39页 |
| 2.1.1 载体和细胞 | 第32-33页 |
| 2.1.2 主要材料和试剂 | 第33-34页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第34页 |
| 2.1.4 试剂配置 | 第34-39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-49页 |
| 2.2.1 克隆hGLRX3基因 | 第39-42页 |
| 2.2.2 重组蛋白6His-hGLRX3的表达及纯化 | 第42-43页 |
| 2.2.3 hGLRX3单克隆抗体的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.4 抗体纯化和亚型分析 | 第44页 |
| 2.2.5 含有GST标签的GLRX3结构域的原核表达 | 第44-46页 |
| 2.2.6 细胞荧光免疫染色 | 第46-47页 |
| 2.2.7 免疫沉淀实验 | 第47-48页 |
| 2.2.8 考马斯亮蓝染色和Western blot | 第48-49页 |
| 2.3 实验结果 | 第49-60页 |
| 2.3.1 hGLRX3基因的克隆 | 第49-50页 |
| 2.3.2 含有6His-hGLRX3的原核表达载体构建及原核表达 | 第50页 |
| 2.3.3 纯化后的6His-hGLRX3融合蛋白检测 | 第50-51页 |
| 2.3.4 hGLRX3单克隆抗体的鉴定 | 第51-60页 |
| 2.4 讨论 | 第60-62页 |
| 第3章 PGRN与GLRX3相互作用的验证研究 | 第62-84页 |
| 3.1 实验材料和仪器 | 第63-67页 |
| 3.1.1 实验菌株、载体和细胞 | 第63-64页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第64页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第64页 |
| 3.1.4 实验试剂配置 | 第64-67页 |
| 3.2 实验方法 | 第67-71页 |
| 3.2.1 构建GLRX3全长及其截短体的酵母表达载体 | 第67页 |
| 3.2.2 酵母双杂交验证PGRN与GLRX3的相互作用 | 第67-68页 |
| 3.2.3 酵母双杂交研究PGRN与GLRX3相互作用的区域 | 第68页 |
| 3.2.4 GST-pull down检测PGRN与GLRX3分子的相互作用 | 第68-70页 |
| 3.2.5 探究PGRRN与GLRX3在细胞中的定位 | 第70页 |
| 3.2.6 Co-IP检测PGRN与GLRX3分子在HEK293细胞中的相互作用 | 第70-71页 |
| 3.3 实验结果 | 第71-81页 |
| 3.3.1 利用酵母双杂交系统验证PGRN与GLRX3的相互作用及相互作用的区域 | 第71-75页 |
| 3.3.2 利用GST-pull down实验在体外验证PGRN与GLRX3的相互作用 | 第75-77页 |
| 3.3.3 利用Confocal和Co-IP在细胞内验证PGRN与GLRX3的相互作用 | 第77-81页 |
| 3.4 讨论 | 第81-84页 |
| 第4章 GLRX3对PGRN蛋白稳定性影响的机制研究 | 第84-102页 |
| 4.1 实验材料和仪器 | 第84-85页 |
| 4.1.1 载体和细胞 | 第84-85页 |
| 4.1.2 主要材料和试剂 | 第85页 |
| 4.1.3 主要仪器设备 | 第85页 |
| 4.1.4 试剂配置 | 第85页 |
| 4.2 实验方法 | 第85-89页 |
| 4.2.1 克隆hGLRX3基因的定点突变体 | 第85-87页 |
| 4.2.2 GLRX3突变体真核表达载体的构建 | 第87页 |
| 4.2.3 RNA提取和反转录 | 第87-88页 |
| 4.2.4 real-time PCR和Western blot检测 | 第88-89页 |
| 4.2.5 Co-IP | 第89页 |
| 4.3 实验结果 | 第89-98页 |
| 4.3.1 GLRX3对PGRN稳定性的影响 | 第89-91页 |
| 4.3.2 GLRX3突变体克隆及其真核表达载体的构建 | 第91-95页 |
| 4.3.3 GLRX3突变体对PGRN稳定性和相互作用的影响 | 第95-96页 |
| 4.3.4 PGRN与GLRX3发生巯基转移的结构域 | 第96-98页 |
| 4.4 讨论 | 第98-102页 |
| 第5章 PGRN与GLRX3相互作用参与EGFR信号途径调控的MDA-MB-231细胞增殖和迁移功能的机制研究 | 第102-152页 |
| 5.1 实验材料 | 第102-103页 |
| 5.1.1 实验菌株、载体和细胞 | 第102-103页 |
| 5.1.2 实验试剂 | 第103页 |
| 5.1.3 实验仪器 | 第103页 |
| 5.1.4 实验试剂配置 | 第103页 |
| 5.2 实验方法 | 第103-115页 |
| 5.2.1 sgRNA的设计和寡核苷酸链合成 | 第103-104页 |
| 5.2.2 T7E1筛选sgRNA打靶效率 | 第104-106页 |
| 5.2.3 构建GLRX3基因敲除和GLRX3与PGRN双基因敲除的打靶载体 | 第106-110页 |
| 5.2.4 构建hGLRX3基因敲除和hGLRX3与hPGRN双基因敲除的细胞系 | 第110-111页 |
| 5.2.5 MTT检测 | 第111页 |
| 5.2.6 划痕实验和Transwell分析 | 第111页 |
| 5.2.7 透射电镜实验 | 第111-112页 |
| 5.2.8 制备表达GLRX3和GLRX3突变体的腺病毒 | 第112页 |
| 5.2.9 Western blot检测 | 第112页 |
| 5.2.10 EGFR promoter的克隆及其调控荧光素酶表达的启动子活性报告载体的构建 | 第112-113页 |
| 5.2.11 双荧光素酶报告基因检测 | 第113-114页 |
| 5.2.12 real-time PCR检测 | 第114-115页 |
| 5.3 实验结果 | 第115-148页 |
| 5.3.1 hGLRX3 sgRNA的设计和筛选 | 第115-116页 |
| 5.3.2 hGLRX3单基因敲除和hGLRX3与hPGRN双基因敲除细胞系的建立 | 第116-130页 |
| 5.3.3 PGRN与GLRX3相互作用对于EGFR promoter活性的影响 | 第130-134页 |
| 5.3.4 PGRN和GLRX3的相互作用对于细胞增殖、迁移的影响 | 第134-138页 |
| 5.3.5 PGRN与GLRX3基因敲除对MDA-MB-231细胞器的影响 | 第138-140页 |
| 5.3.6 PGRN和GLRX3的相互作用对于EGFR信号途径的影响 | 第140-148页 |
| 5.4 讨论 | 第148-152页 |
| 第6章 总结 | 第152-156页 |
| 参考文献 | 第156-170页 |
| 附录 | 第170-172页 |
| 致谢 | 第172-174页 |
| 攻读博士学位期间科研成果 | 第174页 |
