| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 1 | 第7-9页 |
| Abstract 1 | 第9-12页 |
| 摘要 2 | 第12-14页 |
| Abstract 2 | 第14-22页 |
| 第一章 革兰阳性细菌(2型猪链球菌)中NAD~+代谢调控因子NrtR的功能鉴定及其与细菌毒力的关系 | 第22-68页 |
| 1.1 引言 | 第22-31页 |
| 1.1.1 NAD~+的生物特性及在细菌中的生物合成途径 | 第23-24页 |
| 1.1.2 革兰氏阳性菌中NAD~+的代谢途径 | 第24-25页 |
| 1.1.3 NAD~+代谢的调控因子类型 | 第25-28页 |
| 1.1.3.1 NadR调控NAD~+的生物合成 | 第26页 |
| 1.1.3.2 NrtR家族调控NAD~+的生物合成 | 第26页 |
| 1.1.3.3 NiaR(YrxA)调控NAD~+的生物合成 | 第26-27页 |
| 1.1.3.4 其他可能的调控因子及预测更多调控因子的工具 | 第27-28页 |
| 1.1.4 2型猪链球菌与其引发的疫情 | 第28页 |
| 1.1.5 2型猪链球菌的感染途径 | 第28-29页 |
| 1.1.6 2型猪链球菌的毒力因子及致病机制 | 第29-30页 |
| 1.1.7 2型猪链球菌中的NAD~+代谢途径 | 第30页 |
| 1.1.8 本研究目的与意义 | 第30-31页 |
| 1.2 材料与试剂 | 第31-33页 |
| 1.2.1 主要试剂及材料 | 第31页 |
| 1.2.2 培养基及抗生素 | 第31页 |
| 1.2.3 主要缓冲液及配置方法 | 第31页 |
| 1.2.4 主要仪器 | 第31页 |
| 1.2.5 细菌菌株及质粒载体 | 第31-33页 |
| 1.2.6 实验动物 | 第33页 |
| 1.3 实验方法 | 第33-40页 |
| 1.3.1 猪链球菌基因组DNA的提取 | 第33页 |
| 1.3.2 PCR引物设计及扩增 | 第33-34页 |
| 1.3.3 生物信息学分析 | 第34-35页 |
| 1.3.4 S.suis 2突变体△nrtR的构建 | 第35-36页 |
| 1.3.4.1 nrtR基因敲除载体的构建 | 第35页 |
| 1.3.4.2 制备S.suis2细菌感受态 | 第35页 |
| 1.3.4.3 重组质粒pUC19::Spc-nrtRLR电转化S.suis2感受态 | 第35页 |
| 1.3.4.4 PCR初筛敲除株 | 第35-36页 |
| 1.3.4.5 PCR组合分析鉴定 | 第36页 |
| 1.3.5 功能回补株C△nrtR的构建 | 第36页 |
| 1.3.6 比较生长曲线 | 第36-37页 |
| 1.3.7 重组表达质粒的构建及鉴定 | 第37页 |
| 1.3.8 NrtR蛋白的诱导表达 | 第37页 |
| 1.3.9 NrtR重组蛋白的纯化 | 第37页 |
| 1.3.10 分子筛检测重组蛋白 | 第37页 |
| 1.3.11 化学交联 | 第37页 |
| 1.3.12 Western blot检测SsNrtR的乙酰化 | 第37-38页 |
| 1.3.13 透射电镜观察细菌 | 第38页 |
| 1.3.14 lacZ报告菌株的构建 | 第38页 |
| 1.3.15 NrtR的定点突变 | 第38页 |
| 1.3.16 凝胶迁移实验 | 第38-39页 |
| 1.3.17 HPLC体外检测NrtR酶学活性 | 第39页 |
| 1.3.17.1 酶反应体系 | 第39页 |
| 1.3.17.2 高效液相色谱(HPLC)检测 | 第39页 |
| 1.3.18 β-Gal活力检测 | 第39-40页 |
| 1.3.19 动物感染模型实验 | 第40页 |
| 1.3.20 Biofilm生物生成量的测定 | 第40页 |
| 1.3.21 细菌耐药性检测 | 第40页 |
| 1.4 结果与分析 | 第40-64页 |
| 1.4.1 S.suis 2中NAD~+的补救合成途径 | 第40-43页 |
| 1.4.2 S.suis2中NrtR调控因子的结构特征及其同源性分析 | 第43-46页 |
| 1.4.3 S.suis2中NrtR调节子的一般特征 | 第46-49页 |
| 1.4.4 SsNrtR通过结合自身操纵子的启动子实现自抑制调控,此调控可被ADPR解抑制 | 第49-51页 |
| 1.4.5 SsNrtR作为转录抑制因子调控操纵子nadR-punC-nrtR的表达 | 第51页 |
| 1.4.6 K246和R248是NrtR DNA结合结构域的关键氨基酸 | 第51-53页 |
| 1.4.7 Western blot检测SsNrtR的乙酰化 | 第53-55页 |
| 1.4.8 SsNrtR的酶学特征 | 第55-58页 |
| 1.4.9 SsNrtR是S.suis2的一个毒力因子 | 第58-62页 |
| 1.4.10 SsNrtR可能与细菌的耐药性相关 | 第62-64页 |
| 1.5 讨论 | 第64-68页 |
| 第二章 革兰阴性细菌(霍乱弧菌)中NAD~+代谢的调节及NrtR调节子酶学活性的丢失 | 第68-106页 |
| 2.1 引言 | 第68-77页 |
| 2.1.1 革兰氏阴性细菌中NAD~+的代谢途径 | 第69-73页 |
| 2.1.2 霍乱病与霍乱弧菌 | 第73页 |
| 2.1.3 霍乱弧菌的毒力因子及致病机制 | 第73-75页 |
| 2.1.4 霍乱弧菌对抗菌药物的耐药机制 | 第75页 |
| 2.1.5 霍乱弧菌中NAD~+的代谢途径 | 第75-76页 |
| 2.1.6 本研究目的和意义 | 第76-77页 |
| 2.2 材料与试剂 | 第77-79页 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 | 第77页 |
| 2.2.2 培养基及抗生素 | 第77页 |
| 2.2.3 主要缓冲液及配置方法 | 第77页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第77页 |
| 2.2.5 细菌菌株及质粒载体 | 第77-79页 |
| 2.3 实验方法 | 第79-84页 |
| 2.3.1 霍乱弧菌基因组DNA的提取 | 第79页 |
| 2.3.2 PCR引物设计及扩增 | 第79-80页 |
| 2.3.3 生物信息学分析 | 第80页 |
| 2.3.4 V.cholerae突变体△nrtR的构建 | 第80-81页 |
| 2.3.5 功能回补株C△nrtR的构建 | 第81页 |
| 2.3.6 比较生长曲线 | 第81页 |
| 2.3.7 重组表达质粒的构建及鉴定 | 第81页 |
| 2.3.8 VcNrtR蛋白的诱导表达 | 第81-82页 |
| 2.3.9 VcNrtR重组蛋白的纯化 | 第82页 |
| 2.3.10 Western blot检测VcNrtR的乙酰化 | 第82页 |
| 2.3.11 lacZ报告菌株的构建 | 第82页 |
| 2.3.12 VcNrtR的定点突变 | 第82-83页 |
| 2.3.13 凝胶迁移实验 | 第83页 |
| 2.3.14 HPLC体外检测NrtR酶学活性 | 第83页 |
| 2.3.15 β-Gal Assays活力检测 | 第83页 |
| 2.3.16 Biofilm生物生成量的测定 | 第83页 |
| 2.3.17 细菌耐药性检测 | 第83-84页 |
| 2.4 结果与分析 | 第84-103页 |
| 2.4.1 霍乱弧菌中NAD~+的合成途径 | 第84-85页 |
| 2.4.2 霍乱弧菌中NrtR调控因子的生化特征 | 第85-90页 |
| 2.4.3 VcNrtR调控NAD~+合成的相关基因,此调控可被ADPR解抑制 | 第90-93页 |
| 2.4.4 VcNrtR自激活自身的表达,同时作为转录抑制因子调控NAD~+合成PncB所在补救途径的表达 | 第93-97页 |
| 2.4.5 Western blot检测VcNrtR的乙酰化 | 第97-98页 |
| 2.4.6 VcNrtR的酶学特征 | 第98-100页 |
| 2.4.7 VcNrtR可能与细菌的耐药性相关 | 第100-103页 |
| 2.5 结论 | 第103-106页 |
| 第三章 博士学习阶段所参与的其它课题研究 | 第106-109页 |
| 参考文献 | 第109-119页 |
| 附录 | 第119-127页 |
| 1. 主要仪器 | 第119-120页 |
| 2. 主要试剂 | 第120-122页 |
| 主要缓冲液 | 第122-127页 |
| 1. DNA电泳相关试剂 | 第122页 |
| 2. SDS-PAGE试剂及缓冲液 | 第122-123页 |
| 3. SDS-PAGE胶配方 | 第123页 |
| 3.1 12% SDS-PAGE分离胶配方 | 第123页 |
| 3.2 SDS-PAGE浓缩胶配方 | 第123页 |
| 4. 感受态制备相关缓冲液 | 第123-124页 |
| 5. 蛋白表达与纯化缓冲液 | 第124页 |
| 6. 培养基与抗生素配方 | 第124-125页 |
| 7. Western blot相关缓冲液 | 第125页 |
| 8. 透射电镜相关缓冲液 | 第125-126页 |
| 9. β-gal活性检测相关试剂 | 第126-127页 |
| 攻读学位期间发表论文及荣获奖励 | 第127-128页 |
| 1. 发表论文 | 第127-128页 |
| 2. 获得奖项 | 第128页 |
