| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第13-31页 |
| 1.1 核酸适配体概述 | 第13-15页 |
| 1.2 荧光团-核糖核酸适配体“点亮”型生物传感器 | 第15-28页 |
| 1.2.1 点亮核糖核酸适配体筛选 | 第15-16页 |
| 1.2.2 点亮核糖核酸适配体选择激活的染料荧光团种类 | 第16-20页 |
| 1.2.3 工作原理 | 第20-21页 |
| 1.2.4 荧光团-核糖核酸适配体生物传感器用于体外检测的应用 | 第21-23页 |
| 1.2.5 荧光团-核糖核酸适配体传感器用于细胞内成像应用 | 第23-28页 |
| 1.3 基于“点亮”型荧光团-核糖核酸传感器在CRISPR技术中应用 | 第28-30页 |
| 1.3.1 II型CRISPR简介 | 第28-29页 |
| 1.3.2 点亮RNA适配体-荧光团的应用 | 第29-30页 |
| 1.4 本论文研究的构想 | 第30-31页 |
| 第2章 体外转录RNA适配体生物传感器免标记多重检测miRNA分子 | 第31-46页 |
| 2.1 前言 | 第31-32页 |
| 2.2 实验部分 | 第32-36页 |
| 2.2.1 试剂与仪器 | 第32-34页 |
| 2.2.2 DNA-RNA杂交形成Splint连接反应体系 | 第34页 |
| 2.2.3 T7核糖核酸聚合酶体外转录 | 第34页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第34-35页 |
| 2.2.5 核糖核酸适体传感器检测miRNA的荧光测定 | 第35页 |
| 2.2.6 细胞培养及样品制备 | 第35页 |
| 2.2.7 RT-PCR定量检测不同细胞内miRNA21及miRNA141表达水平 | 第35-36页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第36-45页 |
| 2.3.1 实验设计原理 | 第36-37页 |
| 2.3.2 分析方法体外响应验证 | 第37-38页 |
| 2.3.3 凝胶电泳分析 | 第38-40页 |
| 2.3.4 传感器对不同浓度目标物的光谱曲线的测定 | 第40-41页 |
| 2.3.5 分析方法的选择性研究 | 第41-42页 |
| 2.3.6 适体传感器对细胞中总microRNA的测定 | 第42-45页 |
| 2.4 小结 | 第45-46页 |
| 第3章 基于“邻近效应”体外转录产生适配体生物传感器检测前列腺特异性抗原分子 | 第46-60页 |
| 3.1 前言 | 第46-47页 |
| 3.2 实验部分 | 第47-51页 |
| 3.2.1 试剂与仪器 | 第47-48页 |
| 3.2.2 抗体标记的DNA探针的制备 | 第48-49页 |
| 3.2.3 PSA邻近连接反应体系 | 第49页 |
| 3.2.4 体外转录RNA适配体 | 第49页 |
| 3.2.5 荧光测定 | 第49-50页 |
| 3.2.6 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第50页 |
| 3.2.7 ELISA检测 | 第50页 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测 | 第50-51页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第51-59页 |
| 3.3.1 实验设计原理 | 第51-52页 |
| 3.3.2 探针制备 | 第52页 |
| 3.3.3 分析方法的体外验证 | 第52-53页 |
| 3.3.4 实验条件的优化 | 第53-55页 |
| 3.3.5 生物传感器检测PSA | 第55-57页 |
| 3.3.6 传感器特异性研究 | 第57-58页 |
| 3.3.7 血液中PSA的测定 | 第58-59页 |
| 3.4 小结 | 第59-60页 |
| 第4章 遗传编码RNA适配体生物传感器用于活细胞内miR分子的比率型成像研究 | 第60-84页 |
| 4.1 前言 | 第60-61页 |
| 4.2 实验部分 | 第61-67页 |
| 4.2.1 试剂与仪器 | 第61-63页 |
| 4.2.2 黄酰罗丹明B-(PEG)3-二硝基氟苯共轭物的合成 | 第63页 |
| 4.2.3 质粒构建 | 第63-64页 |
| 4.2.4 RNA适体传感器的体外转录 | 第64页 |
| 4.2.5 RNA适体传感器的体外分析 | 第64-65页 |
| 4.2.6 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第65页 |
| 4.2.7 细胞培养和转染 | 第65-66页 |
| 4.2.8 细胞成像 | 第66页 |
| 4.2.9 荧光定量PCR检测RNA适体 | 第66页 |
| 4.2.10 荧光定量PCR检测miRNA | 第66-67页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第67-83页 |
| 4.3.1 实验设计原理 | 第67-69页 |
| 4.3.2 黄酰罗丹B-二硝基氟苯(SR-DN)共轭物的合成与其在细胞中渗透性研究 | 第69-71页 |
| 4.3.3 适体生物传感器的体外优化与合成 | 第71-72页 |
| 4.3.4 适体生物传感器的体外响应实验 | 第72-75页 |
| 4.3.5 质粒转染细胞成像 | 第75-77页 |
| 4.3.6 实时定量PCR分析细胞内生物传感器的表达水平 | 第77页 |
| 4.3.7 质粒构建与表征 | 第77-78页 |
| 4.3.8 细胞共聚焦成像 | 第78-83页 |
| 4.4 小结 | 第83-84页 |
| 第5章 单启动子驱动鲁棒比率型内标和RNA适配体生物传感器用于活细胞内mRNA分子的定量分析 | 第84-108页 |
| 5.1 前言 | 第84-85页 |
| 5.2 实验部分 | 第85-91页 |
| 5.2.1 试剂与仪器 | 第85-87页 |
| 5.2.2 质粒构建 | 第87页 |
| 5.2.3 RNA适体传感器的体外转录 | 第87-88页 |
| 5.2.4 RNA适体传感器的体外分析 | 第88页 |
| 5.2.5 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第88页 |
| 5.2.6 细胞培养和转染 | 第88-89页 |
| 5.2.7 细胞成像 | 第89页 |
| 5.2.8 荧光定量PCR检测GFP和适配体RNA | 第89页 |
| 5.2.9 RNA标准曲线的建立 | 第89-90页 |
| 5.2.10 mRNA绝对定量检测 | 第90-91页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第91-107页 |
| 5.3.1 实验设计原理 | 第91页 |
| 5.3.2 质粒构建示意图 | 第91-92页 |
| 5.3.3 质粒构建与表征 | 第92-94页 |
| 5.3.4 带有鲁棒内标的核酸适体质粒转染后细胞成像 | 第94-95页 |
| 5.3.5 实时定量PCR检测RNA元件的表达 | 第95-98页 |
| 5.3.6 适体传感器的体外响应实验 | 第98-101页 |
| 5.3.7 传感器的体内响应实验 | 第101-102页 |
| 5.3.8 细胞内mRNA拷贝数标准曲线的建立 | 第102-104页 |
| 5.3.9 ROI荧光标准曲线的建立 | 第104-105页 |
| 5.3.10 不同细胞系mRNA定量研究 | 第105-107页 |
| 5.4 小结 | 第107-108页 |
| 第6章 基于CRISPR体系转录激活点亮RNA适配体用于活细胞内mRNA分子成像研究 | 第108-124页 |
| 6.1 前言 | 第108-109页 |
| 6.2 实验部分 | 第109-113页 |
| 6.2.1 实验试剂 | 第109-111页 |
| 6.2.2 体外转录gRNA | 第111页 |
| 6.2.3 DNA体外切割实验 | 第111页 |
| 6.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第111-112页 |
| 6.2.5 质粒构建 | 第112页 |
| 6.2.6 细胞培养和转染 | 第112页 |
| 6.2.7 细胞成像 | 第112-113页 |
| 6.2.8 RT-PCR检测细胞内适配体的表达 | 第113页 |
| 6.2.9 RT-PCR检测细胞内mRNA的表达 | 第113页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第113-122页 |
| 6.3.1 工作原理 | 第113-115页 |
| 6.3.2 质粒表征 | 第115-118页 |
| 6.3.3 质粒DNA体外酶切验证 | 第118-119页 |
| 6.3.4 细胞内RNA分子激活成像 | 第119-121页 |
| 6.3.5 药物处理后细胞成像及RT-PCR | 第121-122页 |
| 6.4 小结 | 第122-124页 |
| 结论 | 第124-126页 |
| 参考文献 | 第126-147页 |
| 附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第147-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
