| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词语索引表 | 第10-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-24页 |
| 1.1 概述 | 第11-12页 |
| 1.2 糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的介绍 | 第12-17页 |
| 1.2.1 哺乳动物细胞中GPI锚定蛋白的结构 | 第12-13页 |
| 1.2.2 哺乳动物细胞中GPI的生物合成途径 | 第13-14页 |
| 1.2.3 新生蛋白质向GPI锚的转移 | 第14-15页 |
| 1.2.4 细胞中GPI锚定蛋白脂质部分的结构重组 | 第15-16页 |
| 1.2.5 人类GPI锚定蛋白合成缺陷导致的遗传疾病 | 第16-17页 |
| 1.3 蛋白质N-糖基化的介绍 | 第17-22页 |
| 1.3.1 蛋白质上N-寡糖链的核心结构 | 第17-18页 |
| 1.3.2 脂质相关的寡糖(LLO)前体的生物合成途径 | 第18-19页 |
| 1.3.3 寡糖基转移酶复合物(OST)催化N-糖链向蛋白质的转移 | 第19-20页 |
| 1.3.4 蛋白质上糖链的加工过程和蛋白质的质量控制 | 第20-21页 |
| 1.3.5 人类N-糖基化缺陷导致的先天性遗传病 | 第21-22页 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 | 第22-24页 |
| 1.4.1 立题依据和研究意义 | 第22页 |
| 1.4.2 本论文主要研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 哺乳动物单倍体细胞筛选GPI锚定蛋白肌醇脱酰基反应的调控因子 | 第24-41页 |
| 2.1 前言 | 第24-26页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第26-33页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和培养条件 | 第26-28页 |
| 2.2.2 试剂、酶及抗体 | 第28-29页 |
| 2.2.3 主要的实验仪器 | 第29页 |
| 2.2.4 质粒的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.5 利用基因诱捕技术在HAP1细胞中进行突变并富集对PI-PLC具有抗性的细胞 | 第30-31页 |
| 2.2.6 测序分析基因诱捕插入位点 | 第31页 |
| 2.2.7 利用CRISPR-Cas9系统在HEK293细胞中敲除候选基因 | 第31-32页 |
| 2.2.8 利用PI-PLC处理细胞及流式细胞仪分析 | 第32页 |
| 2.2.9 免疫荧光检测突变细胞中PGAP1的定位 | 第32页 |
| 2.2.10 荧光定时定量PCR分析突变细胞中PGAP1的表达量 | 第32-33页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第33-39页 |
| 2.3.1 哺乳动物单倍体细胞筛选GPI肌醇脱酰基反应的调控因子 | 第33-35页 |
| 2.3.2 在HEK293细胞中敲出筛选到的基因对GPI肌醇脱酰基的影响 | 第35-37页 |
| 2.3.3 敲除筛选到的基因对细胞中PGAP1表达量和定位的影响 | 第37-39页 |
| 2.4 本章小结 | 第39-41页 |
| 第三章 干扰钙连蛋白循环对GPI肌醇脱酰基反应的影响 | 第41-52页 |
| 3.1 前言 | 第41-42页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第42-46页 |
| 3.2.1 菌株、质粒及培养条件 | 第42页 |
| 3.2.2 试剂、酶及抗体 | 第42-44页 |
| 3.2.3 构建CRISPR-Cas9系统的敲除质粒 | 第44页 |
| 3.2.4 质粒的定点突变 | 第44-45页 |
| 3.2.5 逆转录病毒的包装和细胞转染 | 第45页 |
| 3.2.6 利用PI-PLC处理细胞及流式细胞仪分析 | 第45页 |
| 3.2.7 葡萄糖苷酶抑制剂的处理及分析 | 第45页 |
| 3.2.8 利用CRISPR-Cas9系统敲除基因 | 第45-46页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第46-50页 |
| 3.3.1 研究N-糖链上的葡萄糖剪切对GPI肌醇脱酰基反应过程的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.2 在敲除MOGS基因的细胞中敲除葡萄糖基转移酶对GPI肌醇脱酰基的影响 | 第47-48页 |
| 3.3.3 钙连蛋白的凝集素识别位点的突变对GPI肌醇脱酰基过程的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.4 钙网蛋白与钙连蛋白功能之间的关系 | 第49-50页 |
| 3.4 本章小结 | 第50-52页 |
| 第四章 持续的内质网压力对GPI肌醇脱酰基的影响 | 第52-61页 |
| 4.1 前言 | 第52-54页 |
| 4.2 材料与方法 | 第54-56页 |
| 4.2.1 菌株、质粒及培养条件 | 第54页 |
| 4.2.2 试剂、酶及抗体 | 第54-55页 |
| 4.2.3 构建CRISPR-Cas9系统的敲除质粒 | 第55页 |
| 4.2.4 转录组测序分析HEK293细胞和MOGS-KO细胞的基因表达情况 | 第55-56页 |
| 4.2.5 内质网压力诱导剂处理细胞 | 第56页 |
| 4.2.6 利用CRISPR-Cas9系统敲除基因 | 第56页 |
| 4.2.7 利用PI-PLC处理细胞及流式细胞分析仪检测 | 第56页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第56-60页 |
| 4.3.1 敲除MOGS基因的细胞中基因表达水平的变化情况 | 第56-57页 |
| 4.3.2 内质网压力与GPI肌醇脱酰基反应之间的关系 | 第57-58页 |
| 4.3.3 敲除糖基转移酶催化亚基和钙离子通道基因对GPI肌醇脱酰基反应的影响 | 第58-59页 |
| 4.3.4 敲出糖基转移酶催化亚基对GPI锚定蛋白N-糖基化修饰的影响 | 第59-60页 |
| 4.4 本章小结 | 第60-61页 |
| 第五章 钙连蛋白与GPI锚定蛋白和PGAP1之间的相互关系 | 第61-75页 |
| 5.1 前言 | 第61页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第61-65页 |
| 5.2.1 菌株、质粒及培养条件 | 第61-62页 |
| 5.2.2 定点突变质粒的构建 | 第62页 |
| 5.2.3 试剂、酶及抗体 | 第62-64页 |
| 5.2.4 细胞转染及稳定表达蛋白的细胞株构建 | 第64页 |
| 5.2.5 蛋白质免疫共沉淀及免疫印迹 | 第64页 |
| 5.2.6 放线菌酮(Cycloheximide)追踪实验 | 第64页 |
| 5.2.7 荧光定时定量PCR分析细胞的基因表达量 | 第64-65页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第65-73页 |
| 5.3.1 过量表达错误折叠的GPI锚定蛋白对内源GPI锚定蛋白肌醇脱酰基反应的影响 | 第65-68页 |
| 5.3.2 钙连蛋白与GPI锚定蛋白的相互作用对GPI肌醇脱酰基的影响 | 第68-70页 |
| 5.3.3 钙连蛋白与PGAP1的相互作用对GPI肌醇脱酰基反应的影响 | 第70-72页 |
| 5.3.4 讨论 | 第72-73页 |
| 5.4 本章小结 | 第73-75页 |
| 主要结论与展望 | 第75-77页 |
| 主要结论 | 第75-76页 |
| 展望 | 第76-77页 |
| 论文主要创新点 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-87页 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第87页 |
