| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 灰葡萄孢致病研究 | 第11-15页 |
| 1.1.1 灰葡萄孢致病机理 | 第11-12页 |
| 1.1.2 灰葡萄孢毒素 | 第12-13页 |
| 1.1.3 灰葡萄孢天冬氨酸蛋白酶家族与致病关系 | 第13-14页 |
| 1.1.4 灰葡萄孢致病相关的基因及编码蛋白 | 第14-15页 |
| 1.2 灰葡萄孢病菌的抗药性机理研究 | 第15-19页 |
| 1.2.1 灰葡萄孢病菌的抗药分子机理 | 第15-16页 |
| 1.2.2 灰葡萄孢病菌的抗苯并咪哇类及二甲酰亚胺类杀菌剂机理 | 第16-17页 |
| 1.2.3 有性重组对灰葡萄孢的抗药性作用 | 第17-19页 |
| 1.2.4 准性重组对灰葡萄孢的抗药性作用 | 第19页 |
| 1.3 灰葡萄孢代谢产物的应用 | 第19-21页 |
| 第二章 含双元载体PCMBIA1390的农杆菌构建及灰葡萄孢突变体构建 | 第21-29页 |
| 2.1 材料与方法 | 第21-25页 |
| 2.1.1 菌株 | 第21页 |
| 2.1.2 载体和引物 | 第21-22页 |
| 2.1.3 试剂和仪器 | 第22页 |
| 2.1.4 培养基 | 第22-23页 |
| 2.1.5 方法 | 第23-25页 |
| 2.1.5.1 农杆菌AGL-1感受态细胞的制备 | 第23-24页 |
| 2.1.5.2 灰葡萄孢孢子的收集和计数方法 | 第24页 |
| 2.1.5.3 农杆菌的活化 | 第24页 |
| 2.1.5.4 农杆菌介导的灰葡萄孢的转化 | 第24-25页 |
| 2.1.5.5 转化子抗性稳定性检测 | 第25页 |
| 2.1.5.6 突变体表型初步分析 | 第25页 |
| 2.1.5.7 灰葡萄孢突变体感染番茄分析 | 第25页 |
| 2.2 结果与分析 | 第25-27页 |
| 2.2.1 农杆菌AGL-1(pCAMBIA1390)介导的灰葡萄孢转化子获得 | 第25-26页 |
| 2.2.2 突变体表型初步分析 | 第26-27页 |
| 2.3 小结 | 第27-29页 |
| 第三章 转化子中T-DNA旁侧序列克隆分析 | 第29-50页 |
| 3.1 材料与方法 | 第29-37页 |
| 3.1.1 菌株 | 第29页 |
| 3.1.2 试剂与仪器 | 第29-30页 |
| 3.1.3 灰葡萄孢培养、基因组提取及引物、反应程序 | 第30页 |
| 3.1.4 灰葡萄孢潮霉素抗性基因鉴定 | 第30-31页 |
| 3.1.5 HiTail-PCR引物、体系及程序 | 第31-35页 |
| 3.1.6 切胶回收所需DNA片段 | 第35页 |
| 3.1.7 T-载体连接切胶回收的DNA 片段 | 第35-36页 |
| 3.1.8 大肠杆菌感受态制备及T-载体连接产物转入大肠杆菌感受态 | 第36页 |
| 3.1.9 挑选白斑，初步挑选阳性转化子 | 第36页 |
| 3.1.10 菌落PCR鉴定大肠杆菌的阳性转化子 | 第36-37页 |
| 3.1.11 阳性大肠杆菌培养送去测序 | 第37页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第37-48页 |
| 3.2.1 灰葡萄孢基因组DNA提取 | 第37-38页 |
| 3.2.3 转化子旁侧序列克隆及序列分析 | 第38-48页 |
| 3.2.3.1 7 号转化子旁侧序列克隆（HiTail-PCR）及序列分析 | 第38-42页 |
| 3.2.3.2 1 号转化子旁侧序列克隆（HiTail-PCR）及序列分析 | 第42-43页 |
| 3.2.3.3 10 号转化子旁侧序列克隆（HiTail-PCR）及序列分析 | 第43-46页 |
| 3.2.3.4 9 号转化子旁侧序列克隆（HiTail-PCR）及序列分析 | 第46-47页 |
| 3.2.3.5 20 号转化子旁侧序列克隆（HiTail-PCR）及序列分析 | 第47-48页 |
| 3.3 小结 | 第48-50页 |
| 第四章 转化子分子鉴定 | 第50-66页 |
| 4.1 材料与方法 | 第50-58页 |
| 4.1.1 菌株 | 第50页 |
| 4.1.2 试剂和仪器 | 第50-52页 |
| 4.1.3 灰葡萄孢培养、DNA、RNA提取及引物设计，反应程序 | 第52页 |
| 4.1.4 RT-PCR检测T-DNA插入的基因是否表达 | 第52-55页 |
| 4.1.5 Southern 杂交分析基因的拷贝数 | 第55-58页 |
| 4.1.5.1 探针制备 | 第55-56页 |
| 4.1.5.2 限制性酶酶切基因组DNA | 第56页 |
| 4.1.5.3 酶切及酶切产物处理 | 第56-57页 |
| 4.1.5.4 琼脂凝胶电泳 | 第57页 |
| 4.1.5.5 变性、转膜、与固定 | 第57-58页 |
| 4.1.5.6 DNA 固定 | 第58页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第58-65页 |
| 4.2.1 7 号转化子RT-PCR 分子鉴定 | 第58-60页 |
| 4.2.2 20 号转化子RT-PCR 分子及后续分子鉴定 | 第60-64页 |
| 4.2.3 10 号转化子RT-PCR 分子鉴定 | 第64页 |
| 4.2.4 Southern 结果 | 第64-65页 |
| 4.2.4.1 Southern 杂交探针标定 | 第64-65页 |
| 4.2.4.2 转化子southern 杂交结果 | 第65页 |
| 4.3 讨论与小结 | 第65-66页 |
| 第五章 基因互补克隆 | 第66-70页 |
| 5.1 材料 | 第66-67页 |
| 5.1.1 菌株 | 第66页 |
| 5.1.2 培养基 | 第66页 |
| 5.1.3 试剂和仪器 | 第66页 |
| 5.1.4 引物设计及反应程序 | 第66-67页 |
| 5.2 方法 | 第67-68页 |
| 5.2.1 7 号转化子被插入片段的克隆 | 第67页 |
| 5.2.2 构建pENTR/D-TOPO-Bc7质粒 | 第67页 |
| 5.2.3 构建pCMBIA-Bar-Bc7载体 | 第67-68页 |
| 5.3 结果 | 第68-69页 |
| 5.3.1 7 号转化子被插入片段的克隆 | 第68-69页 |
| 5.3.2 构建pENTR/D-TOPO-Bc7质粒 | 第69页 |
| 5.3.3 构建pCMBIA-Bar-Bc7 载体 | 第69页 |
| 5.4 小结 | 第69-70页 |
| 第六章 7号转化子表型分析 | 第70-76页 |
| 6.1 材料与方法 | 第70-71页 |
| 6.1.1 菌株 | 第70页 |
| 6.1.2 培养基 | 第70页 |
| 6.1.3 试剂和仪器 | 第70页 |
| 6.1.4 方法 | 第70-71页 |
| 6.1.4.1 生长表型观察 | 第70-71页 |
| 6.1.4.2 生长速率测定 | 第71页 |
| 6.1.4.3 7号转化子感染番茄叶面观察 | 第71页 |
| 6.1.4.4 NaCl敏感性实验 | 第71页 |
| 6.2 结果与分析 | 第71-75页 |
| 6.2.1 野生型与7号转化子在不加潮霉素平板和加潮霉素平板上观察 | 第71-73页 |
| 6.2.2 7号转化子与野生型的生长速率 | 第73页 |
| 6.2.3 灰葡萄孢7号转化子侵染番茄叶片分析 | 第73-74页 |
| 6.2.4 药物敏感性实验 | 第74-75页 |
| 6.3 小结 | 第75-76页 |
| 第7章 总结与展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-86页 |
| 致谢 | 第86-88页 |
| 附录 | 第88页 |
