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3-羟基丙酸生产菌关键酶的分子改造及其构建表达

摘要第4-7页
ABSTRACT第7-9页
第一章 绪论第15-32页
    1.1 引言第15页
    1.2 3-羟基丙酸的合成方法第15-16页
    1.3 相关酶简介第16-18页
        1.3.1 甘油脱水酶第16-17页
        1.3.2 醛脱氢酶第17-18页
    1.4 基因工程菌的研究进展第18-24页
        1.4.1 以E.coli作为宿主合成 3-HP第19-21页
        1.4.2 以K. pneumoniae作为宿主合成 3-HP第21-24页
        1.4.3 其他宿主第24页
    1.5 酶的分子改造技术第24-31页
        1.5.1 理性设计第25-28页
            1.5.1.1 寡核苷酸引物介导的定点突变第25-26页
            1.5.1.2 大引物突变法第26页
            1.5.1.3 重叠延伸法第26-27页
            1.5.1.4 盒式突变法第27页
            1.5.1.5 快速定点突变(一步法)第27-28页
        1.5.2 非理性设计第28-30页
            1.5.2.1 易错PCR(error-prone PCR ,EP -PCR)第29页
            1.5.2.2 DNA改组( DNA shuffling )第29-30页
        1.5.3 半理性设计第30-31页
    1.6 本论文选题依据与研究内容第31-32页
第二章 醛脱氢酶的分子改造第32-49页
    2.1 引言第32-33页
    2.2 材料与方法第33-42页
        2.2.1 菌株第33页
        2.2.2 培养基第33页
        2.2.3 主要工具酶和试剂第33页
        2.2.4 主要实验仪器第33-34页
        2.2.5 实验方法第34-42页
            2.2.5.1 质粒的提取第34-35页
            2.2.5.2 PCR体系的建立第35-36页
            2.2.5.3 琼脂糖电泳检测PCR产物第36页
            2.2.5.4 PCR产物酶切第36-37页
            2.2.5.5 大肠杆菌感受态的制备第37页
            2.2.5.6 酶切产物的转化(热击法)第37-38页
            2.2.5.7 阳性克隆的鉴定第38页
            2.2.5.8 酶活检测方法的建立第38-40页
            2.2.5.9 蛋白SDS-PAGE电泳分析第40-41页
            2.2.5.10 测序鉴定第41-42页
    2.3 结果与讨论第42-48页
        2.3.1 醛脱氢酶的定点突变第42页
        2.3.2 醛脱氢酶的多点突变第42-43页
        2.3.3 点突变文库的筛选第43-44页
        2.3.4 突变子序列分析第44页
        2.3.5 突变KGSADH的酶活第44页
        2.3.6 表达产物SDS-PAGE分析第44-45页
        2.3.7 两点组合突变KGSADH的检测结果及SDS-PAGE分析第45-46页
        2.3.8 分子对接第46-48页
        2.3.9 氨基酸的分析与讨论第48页
    2.4 本章小结第48-49页
第三章 突变KGSADH的分离纯化及酶学性质研究第49-61页
    3.1 引言第49页
    3.2 材料与方法第49-52页
        3.2.1 菌种与培养基第49页
        3.2.2 主要仪器和试剂第49-50页
        3.2.3 突变KGSADH的制备第50页
        3.2.4 突变KGSADH的酶活测定第50-51页
        3.2.5 突变KGSADH的酶学性质第51-52页
            3.2.5.1 突变KGSADH最适温度的测定第51页
            3.2.5.2 突变KGSADH的热稳定性研究第51页
            3.2.5.3 突变KGSADH最适pH的测定第51页
            3.2.5.4 突变KGSADH p H稳定性研究第51-52页
            3.2.5.5 金属离子对突变KGSADH酶活的影响第52页
            3.2.5.6 突变KGSADH动力学常数的测定第52页
    3.3 结果与讨论第52-60页
        3.3.1 突变KGSADH的分离纯化第52-53页
        3.3.2 突变醛脱氢酶的酶学性质第53-60页
            3.3.2.1 温度对酶活性的影响第53-54页
            3.3.2.2 突变KGSADH的热稳定性第54-56页
            3.3.2.3 突变KGSADH的最适pH第56-57页
            3.3.2.4 突变KGSADH的pH稳定性第57-58页
            3.3.2.5 金属离子对突变KGSADH酶活的影响第58-59页
            3.3.2.6 酶反应动力学第59-60页
    3.4 本章小结第60-61页
第四章 甘油脱水酶/醛脱氢酶基因工程菌的构建及表达第61-77页
    4.1 引言第61页
    4.2 材料与方法第61-71页
        4.2.1 菌株与质粒第61页
        4.2.2 培养基第61-62页
        4.2.3 主要工具酶、化学试剂及主要仪器第62-63页
        4.2.4 大肠杆菌感受态制备第63页
        4.2.5 蛋白SDS-PAGE电泳分析第63页
        4.2.6 甘油脱水酶/醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达第63-69页
            4.2.6.1 甘油脱水酶基因克隆第63-65页
            4.2.6.2 甘油脱水酶表达载体的构建第65-67页
            4.2.6.3 甘油脱水酶/醛脱氢酶共表达载体的构建第67页
            4.2.6.4 共表达载体诱导表达第67-68页
            4.2.6.5 共表达重组目的蛋白SDS-PAGE分析第68页
            4.2.6.6 E.coli BL21(p CDFDuet-dhaB1-4,p ET-28b-kgsadh)活力检测第68-69页
        4.2.7 分析方法第69-71页
            4.2.7.13-羟基丙酸标准曲线第69-70页
            4.2.7.2 甘油标准曲线第70-71页
    4.3 结果与讨论第71-76页
        4.3.1 甘油脱水酶/醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达第71-76页
            4.3.1.1 甘油脱水酶表达载体的构建第71页
            4.3.1.2 双酶切鉴定甘油脱水酶表达载体第71-72页
            4.3.1.3 甘油脱水酶/醛脱氢酶共表达基因工程菌的构建表达第72-74页
            4.3.1.4 诱导时间对双酶酶活的影响第74-75页
            4.3.1.5 共表达菌株发酵第75-76页
    4.4 本章小结第76-77页
第五章 结论与展望第77-80页
    5.1 结论第77-78页
    5.2 展望第78-80页
参考文献第80-88页
攻读学位期间发表的学术论文第88-89页
致谢第89-91页
附录一第91-94页
附录二第94-99页

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