| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-32页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 3-羟基丙酸的合成方法 | 第15-16页 |
| 1.3 相关酶简介 | 第16-18页 |
| 1.3.1 甘油脱水酶 | 第16-17页 |
| 1.3.2 醛脱氢酶 | 第17-18页 |
| 1.4 基因工程菌的研究进展 | 第18-24页 |
| 1.4.1 以E.coli作为宿主合成 3-HP | 第19-21页 |
| 1.4.2 以K. pneumoniae作为宿主合成 3-HP | 第21-24页 |
| 1.4.3 其他宿主 | 第24页 |
| 1.5 酶的分子改造技术 | 第24-31页 |
| 1.5.1 理性设计 | 第25-28页 |
| 1.5.1.1 寡核苷酸引物介导的定点突变 | 第25-26页 |
| 1.5.1.2 大引物突变法 | 第26页 |
| 1.5.1.3 重叠延伸法 | 第26-27页 |
| 1.5.1.4 盒式突变法 | 第27页 |
| 1.5.1.5 快速定点突变（一步法） | 第27-28页 |
| 1.5.2 非理性设计 | 第28-30页 |
| 1.5.2.1 易错PCR（error-prone PCR ，EP -PCR） | 第29页 |
| 1.5.2.2 DNA改组( DNA shuffling ) | 第29-30页 |
| 1.5.3 半理性设计 | 第30-31页 |
| 1.6 本论文选题依据与研究内容 | 第31-32页 |
| 第二章 醛脱氢酶的分子改造 | 第32-49页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 材料与方法 | 第33-42页 |
| 2.2.1 菌株 | 第33页 |
| 2.2.2 培养基 | 第33页 |
| 2.2.3 主要工具酶和试剂 | 第33页 |
| 2.2.4 主要实验仪器 | 第33-34页 |
| 2.2.5 实验方法 | 第34-42页 |
| 2.2.5.1 质粒的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.5.2 PCR体系的建立 | 第35-36页 |
| 2.2.5.3 琼脂糖电泳检测PCR产物 | 第36页 |
| 2.2.5.4 PCR产物酶切 | 第36-37页 |
| 2.2.5.5 大肠杆菌感受态的制备 | 第37页 |
| 2.2.5.6 酶切产物的转化（热击法） | 第37-38页 |
| 2.2.5.7 阳性克隆的鉴定 | 第38页 |
| 2.2.5.8 酶活检测方法的建立 | 第38-40页 |
| 2.2.5.9 蛋白SDS-PAGE电泳分析 | 第40-41页 |
| 2.2.5.10 测序鉴定 | 第41-42页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第42-48页 |
| 2.3.1 醛脱氢酶的定点突变 | 第42页 |
| 2.3.2 醛脱氢酶的多点突变 | 第42-43页 |
| 2.3.3 点突变文库的筛选 | 第43-44页 |
| 2.3.4 突变子序列分析 | 第44页 |
| 2.3.5 突变KGSADH的酶活 | 第44页 |
| 2.3.6 表达产物SDS-PAGE分析 | 第44-45页 |
| 2.3.7 两点组合突变KGSADH的检测结果及SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| 2.3.8 分子对接 | 第46-48页 |
| 2.3.9 氨基酸的分析与讨论 | 第48页 |
| 2.4 本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 突变KGSADH的分离纯化及酶学性质研究 | 第49-61页 |
| 3.1 引言 | 第49页 |
| 3.2 材料与方法 | 第49-52页 |
| 3.2.1 菌种与培养基 | 第49页 |
| 3.2.2 主要仪器和试剂 | 第49-50页 |
| 3.2.3 突变KGSADH的制备 | 第50页 |
| 3.2.4 突变KGSADH的酶活测定 | 第50-51页 |
| 3.2.5 突变KGSADH的酶学性质 | 第51-52页 |
| 3.2.5.1 突变KGSADH最适温度的测定 | 第51页 |
| 3.2.5.2 突变KGSADH的热稳定性研究 | 第51页 |
| 3.2.5.3 突变KGSADH最适pH的测定 | 第51页 |
| 3.2.5.4 突变KGSADH p H稳定性研究 | 第51-52页 |
| 3.2.5.5 金属离子对突变KGSADH酶活的影响 | 第52页 |
| 3.2.5.6 突变KGSADH动力学常数的测定 | 第52页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第52-60页 |
| 3.3.1 突变KGSADH的分离纯化 | 第52-53页 |
| 3.3.2 突变醛脱氢酶的酶学性质 | 第53-60页 |
| 3.3.2.1 温度对酶活性的影响 | 第53-54页 |
| 3.3.2.2 突变KGSADH的热稳定性 | 第54-56页 |
| 3.3.2.3 突变KGSADH的最适pH | 第56-57页 |
| 3.3.2.4 突变KGSADH的pH稳定性 | 第57-58页 |
| 3.3.2.5 金属离子对突变KGSADH酶活的影响 | 第58-59页 |
| 3.3.2.6 酶反应动力学 | 第59-60页 |
| 3.4 本章小结 | 第60-61页 |
| 第四章 甘油脱水酶/醛脱氢酶基因工程菌的构建及表达 | 第61-77页 |
| 4.1 引言 | 第61页 |
| 4.2 材料与方法 | 第61-71页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第61页 |
| 4.2.2 培养基 | 第61-62页 |
| 4.2.3 主要工具酶、化学试剂及主要仪器 | 第62-63页 |
| 4.2.4 大肠杆菌感受态制备 | 第63页 |
| 4.2.5 蛋白SDS-PAGE电泳分析 | 第63页 |
| 4.2.6 甘油脱水酶/醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第63-69页 |
| 4.2.6.1 甘油脱水酶基因克隆 | 第63-65页 |
| 4.2.6.2 甘油脱水酶表达载体的构建 | 第65-67页 |
| 4.2.6.3 甘油脱水酶/醛脱氢酶共表达载体的构建 | 第67页 |
| 4.2.6.4 共表达载体诱导表达 | 第67-68页 |
| 4.2.6.5 共表达重组目的蛋白SDS-PAGE分析 | 第68页 |
| 4.2.6.6 E.coli BL21(p CDFDuet-dhaB1-4，p ET-28b-kgsadh)活力检测 | 第68-69页 |
| 4.2.7 分析方法 | 第69-71页 |
| 4.2.7.13-羟基丙酸标准曲线 | 第69-70页 |
| 4.2.7.2 甘油标准曲线 | 第70-71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-76页 |
| 4.3.1 甘油脱水酶/醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第71-76页 |
| 4.3.1.1 甘油脱水酶表达载体的构建 | 第71页 |
| 4.3.1.2 双酶切鉴定甘油脱水酶表达载体 | 第71-72页 |
| 4.3.1.3 甘油脱水酶/醛脱氢酶共表达基因工程菌的构建表达 | 第72-74页 |
| 4.3.1.4 诱导时间对双酶酶活的影响 | 第74-75页 |
| 4.3.1.5 共表达菌株发酵 | 第75-76页 |
| 4.4 本章小结 | 第76-77页 |
| 第五章 结论与展望 | 第77-80页 |
| 5.1 结论 | 第77-78页 |
| 5.2 展望 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-91页 |
| 附录一 | 第91-94页 |
| 附录二 | 第94-99页 |
