| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 英文缩写对照表 | 第10-11页 |
| 一、综述 | 第11-28页 |
| 1.1 病原学 | 第11-12页 |
| 1.2 猪瘟病毒结构及其蛋白功能的特点 | 第12-19页 |
| 1.2.1 3'端非编码区 | 第13-14页 |
| 1.2.2 5'端非编码区 | 第14页 |
| 1.2.3 N~(pro) | 第14-15页 |
| 1.2.4 Core | 第15页 |
| 1.2.5 E~(rns),E1和E2 | 第15-16页 |
| 1.2.6 P7 | 第16-17页 |
| 1.2.7 NS2,NS3 | 第17-18页 |
| 1.2.8 NS4A,NS4B | 第18页 |
| 1.2.9 NS5A,NS5B | 第18-19页 |
| 1.3 猪瘟病毒的致病机理 | 第19-23页 |
| 1.3.1 猪瘟病毒生命周期 | 第19-20页 |
| 1.3.2 猪瘟病毒致病机制 | 第20-22页 |
| 1.3.3 猪瘟病毒免疫抑制 | 第22-23页 |
| 1.4 IRG6 | 第23-25页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第25-28页 |
| 二、材料与方法 | 第28-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-35页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第28页 |
| 2.1.2 病毒、质粒、细胞与菌株 | 第28页 |
| 2.1.3 引物合成 | 第28-30页 |
| 2.1.4 试剂及配制 | 第30-34页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第34-35页 |
| 2.2 技术路线 | 第35-36页 |
| 2.2.1 猪瘟病毒C蛋白和NS3蛋白原核表达载体的构建与多克隆抗体制备 | 第35页 |
| 2.2.2 猪瘟病毒与IRG6相互作用机制的初步探索 | 第35-36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-50页 |
| 2.3.1 扩增目的基因 | 第36-37页 |
| 2.3.2 电泳和胶回收 | 第37页 |
| 2.3.3 连接基因片段 | 第37页 |
| 2.3.4 制备TOP10感受态细胞 | 第37-38页 |
| 2.3.5 转化连接产物 | 第38页 |
| 2.3.6 质粒抽提及双酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.7 制备Rosetta感受态细胞 | 第39页 |
| 2.3.8 构建原核表达质粒 | 第39页 |
| 2.3.9 重组菌的诱导表达及Western blot鉴定 | 第39-42页 |
| 2.3.10 重组蛋白表达形式的鉴定 | 第42页 |
| 2.3.11 蛋白的纯化与复性 | 第42-44页 |
| 2.3.12 重组蛋白免疫小鼠制备抗体 | 第44页 |
| 2.3.13 多克隆抗体特异性及效价检测 | 第44-45页 |
| 2.3.14 病毒的培养 | 第45-46页 |
| 2.3.15 病毒感染滴度测定方法 | 第46页 |
| 2.3.16 qRT-PCR | 第46-50页 |
| 三、实验结果 | 第50-74页 |
| 3.1 C蛋白原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 | 第50-59页 |
| 3.1.1 C基因片段的克隆 | 第51-52页 |
| 3.1.2 原核表达载体pET-C的构建 | 第52-53页 |
| 3.1.3 重组质粒pET-C的诱导表达 | 第53-54页 |
| 3.1.4 重组蛋白C表达形式的鉴定 | 第54-55页 |
| 3.1.5 重组蛋白C的纯化 | 第55-56页 |
| 3.1.6 纯化的重组蛋白C的鉴定 | 第56-57页 |
| 3.1.7 Western blot检测C蛋白多克隆抗体与重组蛋白反应性 | 第57-58页 |
| 3.1.8 Western blot检测C蛋白多克隆抗体与PK-15细胞中C蛋白的反应性 | 第58-59页 |
| 3.2 NS3蛋白原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 | 第59-68页 |
| 3.2.1 NS3基因片段的克隆 | 第60-61页 |
| 3.2.2 原核表达载体pET-NS3的构建 | 第61-62页 |
| 3.2.3 重组质粒pET-NS3的诱导表达 | 第62-63页 |
| 3.2.4 重组蛋白NS3表达形式的鉴定 | 第63-64页 |
| 3.2.5 重组蛋白NS3的纯化 | 第64-65页 |
| 3.2.6 纯化的重组蛋白NS3的鉴定 | 第65-66页 |
| 3.2.7 Western blot检测NS3蛋白多克隆抗体与重组蛋白反应性 | 第66-67页 |
| 3.2.8 Western blot检测NS3蛋白多克隆抗体与PK-15细胞中NS3蛋白的反应性 | 第67-68页 |
| 3.3 猪瘟病毒与IRG6相互作用的初步探索 | 第68-74页 |
| 3.3.1 细胞系的鉴定 | 第68-69页 |
| 3.3.2 实时荧光定量PCR引物标准曲线的建立 | 第69-70页 |
| 3.3.3 过表达IRG6对猪瘟病毒RNA的影响 | 第70-72页 |
| 3.3.4 测定过表达IRG6对猪瘟病毒滴度的影响 | 第72-73页 |
| 3.3.5 测定过表达IRG6对猪瘟病毒蛋白的影响 | 第73-74页 |
| 四、讨论 | 第74-80页 |
| 4.1 基因原核表达片段的选择 | 第74-75页 |
| 4.2 原核表达策略 | 第75-76页 |
| 4.3 重组蛋白的纯化 | 第76-77页 |
| 4.4 多克隆抗体的特异性及效价问题 | 第77-78页 |
| 4.5 多克隆抗体的重要性及应用前景 | 第78页 |
| 4.6 猪瘟病毒与IRG6相互作用的初步探索 | 第78-80页 |
| 五、小结 | 第80-81页 |
| 六、参考文献 | 第81-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第92页 |
