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鸭瘟病毒gE基因功能初步研究

本论文的创新性工作第1-6页
中文摘要第6-9页
ABSTRACT第9-13页
常用英文缩写词汇第13-21页
第一部分 文献综述第21-32页
 第一章 疱疹病毒gE基因及其编码蛋白的研究进展第21-32页
  1. 疱疹病毒gE基因的特点第22-24页
   ·疱疹病毒gE基因序列特点第22页
   ·疱疹病毒gE基因的类型第22-24页
  2. 疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构及功能第24-27页
   ·疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构特点第24页
   ·疱疹病毒gE基因编码蛋白的功能第24-27页
     ·糖蛋白gE胞外区的功能第24-26页
     ·糖蛋白gE细胞质区的功能第26-27页
  3 疱疹病毒gE蛋白与其他蛋白的相互作用第27-31页
   ·gE蛋白与gI蛋白的相互作用第27-28页
   ·gE蛋白与VP22、gM、gD蛋白的相互作用第28-30页
   ·gE蛋白与US9蛋白第30-31页
  4 选题目的和意义第31-32页
第二部分 实验研究第32-157页
 第二章 DPV gE基因序列特征及其密码子偏爱性的生物信息学分析第32-51页
  1 材料和方法第32-34页
   ·材料第32-33页
     ·基因文库第32-33页
     ·主要生物信息学分析软件第33页
     ·试验数据第33页
   ·方法第33-34页
     ·DPV gE基因生物信息学分析的方法第33-34页
     ·DPV gE基因的密码子偏爱性分析第34页
  2 结果第34-43页
   ·DPV gE基因的序列特征第34页
   ·DPV gE基因编码蛋白的序列特征第34-35页
   ·DPV gE基因编码蛋白的功能预测第35-39页
     ·跨膜区的预测结果第35页
     ·信号肽预测结果第35页
     ·亚细胞定位分析结果第35-36页
     ·DPV gE蛋白翻译后修饰的预测结果第36页
     ·DPV gE蛋白疏水性分析及抗原性分析第36-39页
     ·DPV gE蛋白的二级结构与三级结构的预测第39页
   ·DPV gE蛋白的系统进化树分析第39-40页
   ·DPV gE基因的密码子偏爱性分析第40-43页
     ·DPV gE基因与17种疱疹病毒gE基因间的密码子偏爱性分析第40-42页
     ·DPV gE基因的密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析第42页
     ·DPV gE基因稀有密码子的分析第42-43页
     ·DPV gE基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较第43页
  3 讨论第43-49页
   ·DPV gE蛋白序列的分子特性分析第43-44页
   ·DPV gE蛋白的抗原性和高级结构特点第44-45页
   ·DPV gE蛋白与其它α-疱疹病毒gE蛋白的系统进化关系第45-47页
   ·DPVgE基因的密码子偏爱性分析及其对表达的影响第47-49页
  4 小结第49-50页
  Abstract第50-51页
 第三章 gE基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备第51-78页
  1. 试验材料第51-55页
   ·毒株与菌株第51页
   ·工具酶及主要试剂盒第51-52页
   ·主要试剂配制第52-54页
     ·核酸电泳试剂第52-53页
     ·SDS-PAGE凝胶电泳试剂第53-54页
     ·表达产物纯化试剂配制第54页
     ·Western blotting试剂第54页
   ·其他试剂配制第54-55页
   ·主要实验设备第55页
  2. 试验方法第55-64页
   ·构建DPV gE基因的克隆载体pMD18-T-gE第55-59页
     ·鸭瘟病毒(DPV)基因组DNA的提取第55-56页
     ·PCR扩增鸭瘟病毒(DPV)gE基因第56-57页
     ·DPV gE基因的T-载体克隆与鉴定第57-59页
   ·构建DPV gE基因的原核表达载体第59-60页
     ·表达质粒pET-32a(+)与重组质粒pMD18-T-gE的提取、酶切及回收第59页
     ·重组表达菌株的构建第59-60页
   ·重组蛋白的诱导表达及条件优化第60-61页
     ·制备感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS第60页
     ·重组表达质粒转化至感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS第60页
     ·重组表达菌株的培养及表达第60-61页
     ·重组蛋白表达条件的优化第61页
   ·纯化重组蛋白第61-63页
     ·重组表达蛋白的可溶性分析第61-62页
     ·重组表达蛋白的大量制备第62页
     ·Western Blotting检测第62-63页
   ·兔抗重组表达蛋白高免血清的制备与纯化第63-64页
     ·兔抗重组蛋白高免血清的制备第63页
     ·兔抗重组蛋白高免血清IgG的纯化及鉴定第63-64页
  3. 结果第64-71页
   ·DPV gE基因的扩增、T-克隆与鉴定第64页
   ·原核表达载体pET32a-gE的构建与鉴定第64-65页
   ·重组蛋白pET32a/DPV-gE的诱导表达第65-67页
     ·诱导表达重组蛋白pET32a/DPV-gE第65页
     ·诱导重组蛋白pET32a/DPV-gE表达的条件优化第65-67页
   ·重组蛋白pET32a/DPV-gE的纯化第67页
     ·重组蛋白的可溶性分析第67页
     ·重组蛋白的大量纯化第67页
   ·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清的制备第67-69页
     ·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清效价测定第67-69页
     ·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清IgG的纯化第69页
   ·Western Blotting检测第69-71页
  4. 讨论第71-76页
   ·DPV gE基因的引物设计和克隆测序第71-72页
   ·DPV gE表达载体的选择第72-73页
   ·诱导表达条件的优化第73-74页
   ·包涵体的形成第74-75页
   ·疱疹病毒gE基因的表达第75页
   ·兔抗重组蛋白pET32a/DPV gE抗体的制备和纯化第75-76页
  5. 小结第76-77页
  Abstract第77-78页
 第四章 鸭瘟病毒gE蛋白在病毒感染宿主细胞中定位第78-89页
  1 材料第78-79页
   ·毒株第78页
   ·主要试剂及仪器设备第78-79页
  2 试验方法第79-80页
   ·检测DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的定位第79页
   ·间接免疫荧光方法的条件优化第79-80页
   ·特异性检测第80页
   ·结果判定标准第80页
   ·DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的动态监测第80页
  3 结果第80-82页
   ·间接免疫荧光检测DPV gE蛋白的细胞内定位方法的建立及优化第80页
   ·特异性试验第80-82页
   ·间接免疫荧光法检测DPVgE蛋白在DPV感染细胞中定位的动态第82页
  4 讨论第82-87页
   ·关于特定蛋白在细胞定位的研究方法第82-83页
   ·间接免疫荧光方法检测细胞定位的条件优化第83-84页
   ·DPV gE基因表达产物在宿主细胞定位的分析第84-86页
   ·疱疹病毒gE蛋白的亚细胞定位与其功能的关系第86-87页
  5 小结第87-88页
  Abstract第88-89页
 第五章 DPV gE基因在宿主细胞的转录和表达特征第89-106页
  1. 材料第89-90页
   ·毒株、菌株、细胞及抗体第89页
   ·主要试剂及其配制第89-90页
   ·主要仪器设备第90页
  2. 试验方法第90-94页
   ·荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相第90-94页
     ·荧光定量PCR引物设计与合成第90-91页
     ·荧光定量PCR标准曲线的制作第91-94页
   ·Western blotting检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达时相第94页
     ·DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达第94页
     ·DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达特征第94页
  3. 结果第94-101页
   ·DPV gE基因在宿主细胞中的转录特征第94-100页
     ·RNA完整性及纯度分析第94-95页
     ·引物特异性分析第95页
     ·β-actin内参基因的T-克隆与鉴定第95-96页
     ·标准曲线的制作第96页
     ·DPV gE基因在宿主细胞中的转录分析第96-100页
   ·DPV gE基因在宿主细胞中的表达特征第100-101页
     ·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG特异性分析第100页
     ·DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析第100-101页
  4. 讨论第101-104页
   ·运用实时荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相第101-102页
   ·分析DPV gE基因转录特征第102-103页
   ·Western blotting方法检测DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析第103-104页
  5. 小结第104-105页
  Abstract第105-106页
 第六章 利用间接免疫酶组化法(IPA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律第106-127页
  1 材料第106-107页
   ·毒株及抗体第106页
   ·试验动物及其他组织材料第106页
   ·试剂及配制第106-107页
   ·主要仪器设备第107页
  2 方法第107-110页
   ·组织样品的制备第107-108页
     ·试验动物分组及采集样品第107-108页
     ·固定、包埋样品和制备切片第108页
   ·建立并优化间接免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的分布第108-110页
     ·间接免疫酶组化法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布第108-109页
     ·检测DPV gE蛋白组织定位的间接免疫酶组化法的条件优化第109页
     ·特异性试验第109-110页
     ·结果判定标准第110页
     ·DPV gE蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态监测第110页
  3 结果第110-122页
   ·间接免疫酶组化检测DPV gE蛋白组织定位方法的最佳优化条件第110-111页
   ·特异性试验第111-114页
   ·DPV gE蛋白在感染鸭组织中的定位和动态分布第114-122页
     ·淋巴器官第115-118页
     ·消化器官第118-120页
     ·其它器官第120-122页
  4. 讨论第122-125页
   ·免疫酶组化检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化第123-124页
   ·间接免疫酶组化法检测DPVgE蛋白在感染鸭组织中的定位与分布第124-125页
  5. 小结第125-126页
  Abstract第126-127页
 第七章 用间接免疫荧光方法(IFA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布第127-145页
  1 材料第127-128页
   ·抗体、毒株及试验动物第127页
   ·试剂及配制第127-128页
  2 方法第128-130页
   ·玻片处理及样品制备第128页
   ·切片第128页
   ·建立与优化基于pET32a/DPV-gE IgG介导的间接免疫荧光方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的定位第128-130页
   ·利用IFA检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布第130页
  3 结果第130-140页
   ·间接免疫荧光检测DPV gE蛋白组织定位方法的优化结果第130-131页
   ·特异性试验结果第131-134页
   ·应用间接免疫荧光检测DPV gE在感染鸭组织中的定位及动态分布第134-140页
  4. 讨论第140-143页
   ·间接免疫荧光法检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化第140-141页
   ·间接免疫荧光法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布第141-142页
   ·间接免疫荧光方法与免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在人工感染鸭体内的定位及分布规律比较第142-143页
  5. 小结第143-144页
  Abstract第144-145页
 第八章 基于重组蛋白pET32a/DPV-gE的间接ELISA法检测鸭瘟病毒抗体的建立及应用第145-157页
  1 材料第145-146页
   ·毒株、菌株及血清第145页
   ·主要试剂及配制第145-146页
   ·主要仪器第146页
  2 方法第146-148页
   ·重组蛋白pET32a/DPV-gE的大量制备和纯化第146-147页
   ·pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体方法的建立第147-148页
     ·pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的检测程序第147页
     ·优化最佳的酶标二抗稀释度第147页
     ·优化最佳的包被抗原浓度及血清稀释度第147-148页
     ·pET 32a/DPV-gE-ELISA方法临界值的确定第148页
     ·特异性试验第148页
     ·敏感性试验第148页
     ·重复性试验第148页
   ·pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体的应用第148页
  3 结果第148-153页
   ·重组蛋白pET 32a/DPV-gE纯化的检测结果第148-149页
   ·pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的建立第149-152页
     ·最佳酶标二抗稀释度的检测结果第149页
     ·最佳的包被抗原浓度及待检血清稀释度第149-151页
     ·ELISA阴阳性临界值的判定标准第151页
     ·特异性试验的检测结果第151页
     ·敏感性试验的检测结果第151-152页
     ·重复性试验的检测结果第152页
   ·地方血清样品检测结果第152-153页
  4. 讨论第153-155页
   ·包被抗原的选择第153-154页
   ·基于重组蛋白pET 32a/DPV-gE建立间接ELISA方法检测DPV抗体的优化第154-155页
  5. 小结第155-156页
  Abstract第156-157页
结论第157-159页
参考文献第159-175页
致谢第175-176页
作者简介第176页

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