本论文的创新性工作 | 第1-6页 |
中文摘要 | 第6-9页 |
ABSTRACT | 第9-13页 |
常用英文缩写词汇 | 第13-21页 |
第一部分 文献综述 | 第21-32页 |
第一章 疱疹病毒gE基因及其编码蛋白的研究进展 | 第21-32页 |
1. 疱疹病毒gE基因的特点 | 第22-24页 |
·疱疹病毒gE基因序列特点 | 第22页 |
·疱疹病毒gE基因的类型 | 第22-24页 |
2. 疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构及功能 | 第24-27页 |
·疱疹病毒gE基因编码蛋白的结构特点 | 第24页 |
·疱疹病毒gE基因编码蛋白的功能 | 第24-27页 |
·糖蛋白gE胞外区的功能 | 第24-26页 |
·糖蛋白gE细胞质区的功能 | 第26-27页 |
3 疱疹病毒gE蛋白与其他蛋白的相互作用 | 第27-31页 |
·gE蛋白与gI蛋白的相互作用 | 第27-28页 |
·gE蛋白与VP22、gM、gD蛋白的相互作用 | 第28-30页 |
·gE蛋白与US9蛋白 | 第30-31页 |
4 选题目的和意义 | 第31-32页 |
第二部分 实验研究 | 第32-157页 |
第二章 DPV gE基因序列特征及其密码子偏爱性的生物信息学分析 | 第32-51页 |
1 材料和方法 | 第32-34页 |
·材料 | 第32-33页 |
·基因文库 | 第32-33页 |
·主要生物信息学分析软件 | 第33页 |
·试验数据 | 第33页 |
·方法 | 第33-34页 |
·DPV gE基因生物信息学分析的方法 | 第33-34页 |
·DPV gE基因的密码子偏爱性分析 | 第34页 |
2 结果 | 第34-43页 |
·DPV gE基因的序列特征 | 第34页 |
·DPV gE基因编码蛋白的序列特征 | 第34-35页 |
·DPV gE基因编码蛋白的功能预测 | 第35-39页 |
·跨膜区的预测结果 | 第35页 |
·信号肽预测结果 | 第35页 |
·亚细胞定位分析结果 | 第35-36页 |
·DPV gE蛋白翻译后修饰的预测结果 | 第36页 |
·DPV gE蛋白疏水性分析及抗原性分析 | 第36-39页 |
·DPV gE蛋白的二级结构与三级结构的预测 | 第39页 |
·DPV gE蛋白的系统进化树分析 | 第39-40页 |
·DPV gE基因的密码子偏爱性分析 | 第40-43页 |
·DPV gE基因与17种疱疹病毒gE基因间的密码子偏爱性分析 | 第40-42页 |
·DPV gE基因的密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析 | 第42页 |
·DPV gE基因稀有密码子的分析 | 第42-43页 |
·DPV gE基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较 | 第43页 |
3 讨论 | 第43-49页 |
·DPV gE蛋白序列的分子特性分析 | 第43-44页 |
·DPV gE蛋白的抗原性和高级结构特点 | 第44-45页 |
·DPV gE蛋白与其它α-疱疹病毒gE蛋白的系统进化关系 | 第45-47页 |
·DPVgE基因的密码子偏爱性分析及其对表达的影响 | 第47-49页 |
4 小结 | 第49-50页 |
Abstract | 第50-51页 |
第三章 gE基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 | 第51-78页 |
1. 试验材料 | 第51-55页 |
·毒株与菌株 | 第51页 |
·工具酶及主要试剂盒 | 第51-52页 |
·主要试剂配制 | 第52-54页 |
·核酸电泳试剂 | 第52-53页 |
·SDS-PAGE凝胶电泳试剂 | 第53-54页 |
·表达产物纯化试剂配制 | 第54页 |
·Western blotting试剂 | 第54页 |
·其他试剂配制 | 第54-55页 |
·主要实验设备 | 第55页 |
2. 试验方法 | 第55-64页 |
·构建DPV gE基因的克隆载体pMD18-T-gE | 第55-59页 |
·鸭瘟病毒(DPV)基因组DNA的提取 | 第55-56页 |
·PCR扩增鸭瘟病毒(DPV)gE基因 | 第56-57页 |
·DPV gE基因的T-载体克隆与鉴定 | 第57-59页 |
·构建DPV gE基因的原核表达载体 | 第59-60页 |
·表达质粒pET-32a(+)与重组质粒pMD18-T-gE的提取、酶切及回收 | 第59页 |
·重组表达菌株的构建 | 第59-60页 |
·重组蛋白的诱导表达及条件优化 | 第60-61页 |
·制备感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS | 第60页 |
·重组表达质粒转化至感受态细胞BL21、Rosetta和pLysS | 第60页 |
·重组表达菌株的培养及表达 | 第60-61页 |
·重组蛋白表达条件的优化 | 第61页 |
·纯化重组蛋白 | 第61-63页 |
·重组表达蛋白的可溶性分析 | 第61-62页 |
·重组表达蛋白的大量制备 | 第62页 |
·Western Blotting检测 | 第62-63页 |
·兔抗重组表达蛋白高免血清的制备与纯化 | 第63-64页 |
·兔抗重组蛋白高免血清的制备 | 第63页 |
·兔抗重组蛋白高免血清IgG的纯化及鉴定 | 第63-64页 |
3. 结果 | 第64-71页 |
·DPV gE基因的扩增、T-克隆与鉴定 | 第64页 |
·原核表达载体pET32a-gE的构建与鉴定 | 第64-65页 |
·重组蛋白pET32a/DPV-gE的诱导表达 | 第65-67页 |
·诱导表达重组蛋白pET32a/DPV-gE | 第65页 |
·诱导重组蛋白pET32a/DPV-gE表达的条件优化 | 第65-67页 |
·重组蛋白pET32a/DPV-gE的纯化 | 第67页 |
·重组蛋白的可溶性分析 | 第67页 |
·重组蛋白的大量纯化 | 第67页 |
·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清的制备 | 第67-69页 |
·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清效价测定 | 第67-69页 |
·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE高免血清IgG的纯化 | 第69页 |
·Western Blotting检测 | 第69-71页 |
4. 讨论 | 第71-76页 |
·DPV gE基因的引物设计和克隆测序 | 第71-72页 |
·DPV gE表达载体的选择 | 第72-73页 |
·诱导表达条件的优化 | 第73-74页 |
·包涵体的形成 | 第74-75页 |
·疱疹病毒gE基因的表达 | 第75页 |
·兔抗重组蛋白pET32a/DPV gE抗体的制备和纯化 | 第75-76页 |
5. 小结 | 第76-77页 |
Abstract | 第77-78页 |
第四章 鸭瘟病毒gE蛋白在病毒感染宿主细胞中定位 | 第78-89页 |
1 材料 | 第78-79页 |
·毒株 | 第78页 |
·主要试剂及仪器设备 | 第78-79页 |
2 试验方法 | 第79-80页 |
·检测DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的定位 | 第79页 |
·间接免疫荧光方法的条件优化 | 第79-80页 |
·特异性检测 | 第80页 |
·结果判定标准 | 第80页 |
·DPV gE蛋白在感染宿主细胞中的动态监测 | 第80页 |
3 结果 | 第80-82页 |
·间接免疫荧光检测DPV gE蛋白的细胞内定位方法的建立及优化 | 第80页 |
·特异性试验 | 第80-82页 |
·间接免疫荧光法检测DPVgE蛋白在DPV感染细胞中定位的动态 | 第82页 |
4 讨论 | 第82-87页 |
·关于特定蛋白在细胞定位的研究方法 | 第82-83页 |
·间接免疫荧光方法检测细胞定位的条件优化 | 第83-84页 |
·DPV gE基因表达产物在宿主细胞定位的分析 | 第84-86页 |
·疱疹病毒gE蛋白的亚细胞定位与其功能的关系 | 第86-87页 |
5 小结 | 第87-88页 |
Abstract | 第88-89页 |
第五章 DPV gE基因在宿主细胞的转录和表达特征 | 第89-106页 |
1. 材料 | 第89-90页 |
·毒株、菌株、细胞及抗体 | 第89页 |
·主要试剂及其配制 | 第89-90页 |
·主要仪器设备 | 第90页 |
2. 试验方法 | 第90-94页 |
·荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相 | 第90-94页 |
·荧光定量PCR引物设计与合成 | 第90-91页 |
·荧光定量PCR标准曲线的制作 | 第91-94页 |
·Western blotting检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达时相 | 第94页 |
·DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达 | 第94页 |
·DPV gE基因在感染宿主细胞中的表达特征 | 第94页 |
3. 结果 | 第94-101页 |
·DPV gE基因在宿主细胞中的转录特征 | 第94-100页 |
·RNA完整性及纯度分析 | 第94-95页 |
·引物特异性分析 | 第95页 |
·β-actin内参基因的T-克隆与鉴定 | 第95-96页 |
·标准曲线的制作 | 第96页 |
·DPV gE基因在宿主细胞中的转录分析 | 第96-100页 |
·DPV gE基因在宿主细胞中的表达特征 | 第100-101页 |
·兔抗重组蛋白pET32a/DPV-gE IgG特异性分析 | 第100页 |
·DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析 | 第100-101页 |
4. 讨论 | 第101-104页 |
·运用实时荧光定量PCR方法检测DPV gE基因在感染宿主细胞中的转录时相 | 第101-102页 |
·分析DPV gE基因转录特征 | 第102-103页 |
·Western blotting方法检测DPV gE基因在宿主细胞中的表达时相分析 | 第103-104页 |
5. 小结 | 第104-105页 |
Abstract | 第105-106页 |
第六章 利用间接免疫酶组化法(IPA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布规律 | 第106-127页 |
1 材料 | 第106-107页 |
·毒株及抗体 | 第106页 |
·试验动物及其他组织材料 | 第106页 |
·试剂及配制 | 第106-107页 |
·主要仪器设备 | 第107页 |
2 方法 | 第107-110页 |
·组织样品的制备 | 第107-108页 |
·试验动物分组及采集样品 | 第107-108页 |
·固定、包埋样品和制备切片 | 第108页 |
·建立并优化间接免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的分布 | 第108-110页 |
·间接免疫酶组化法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布 | 第108-109页 |
·检测DPV gE蛋白组织定位的间接免疫酶组化法的条件优化 | 第109页 |
·特异性试验 | 第109-110页 |
·结果判定标准 | 第110页 |
·DPV gE蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态监测 | 第110页 |
3 结果 | 第110-122页 |
·间接免疫酶组化检测DPV gE蛋白组织定位方法的最佳优化条件 | 第110-111页 |
·特异性试验 | 第111-114页 |
·DPV gE蛋白在感染鸭组织中的定位和动态分布 | 第114-122页 |
·淋巴器官 | 第115-118页 |
·消化器官 | 第118-120页 |
·其它器官 | 第120-122页 |
4. 讨论 | 第122-125页 |
·免疫酶组化检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化 | 第123-124页 |
·间接免疫酶组化法检测DPVgE蛋白在感染鸭组织中的定位与分布 | 第124-125页 |
5. 小结 | 第125-126页 |
Abstract | 第126-127页 |
第七章 用间接免疫荧光方法(IFA)检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布 | 第127-145页 |
1 材料 | 第127-128页 |
·抗体、毒株及试验动物 | 第127页 |
·试剂及配制 | 第127-128页 |
2 方法 | 第128-130页 |
·玻片处理及样品制备 | 第128页 |
·切片 | 第128页 |
·建立与优化基于pET32a/DPV-gE IgG介导的间接免疫荧光方法检测DPV gE蛋白在感染鸭组织的定位 | 第128-130页 |
·利用IFA检测DPV gE蛋白在感染鸭组织中的分布 | 第130页 |
3 结果 | 第130-140页 |
·间接免疫荧光检测DPV gE蛋白组织定位方法的优化结果 | 第130-131页 |
·特异性试验结果 | 第131-134页 |
·应用间接免疫荧光检测DPV gE在感染鸭组织中的定位及动态分布 | 第134-140页 |
4. 讨论 | 第140-143页 |
·间接免疫荧光法检测DPV gE蛋白的定位方法的建立与优化 | 第140-141页 |
·间接免疫荧光法检测在感染鸭组织中DPV gE蛋白的分布 | 第141-142页 |
·间接免疫荧光方法与免疫酶组化方法检测DPV gE蛋白在人工感染鸭体内的定位及分布规律比较 | 第142-143页 |
5. 小结 | 第143-144页 |
Abstract | 第144-145页 |
第八章 基于重组蛋白pET32a/DPV-gE的间接ELISA法检测鸭瘟病毒抗体的建立及应用 | 第145-157页 |
1 材料 | 第145-146页 |
·毒株、菌株及血清 | 第145页 |
·主要试剂及配制 | 第145-146页 |
·主要仪器 | 第146页 |
2 方法 | 第146-148页 |
·重组蛋白pET32a/DPV-gE的大量制备和纯化 | 第146-147页 |
·pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体方法的建立 | 第147-148页 |
·pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的检测程序 | 第147页 |
·优化最佳的酶标二抗稀释度 | 第147页 |
·优化最佳的包被抗原浓度及血清稀释度 | 第147-148页 |
·pET 32a/DPV-gE-ELISA方法临界值的确定 | 第148页 |
·特异性试验 | 第148页 |
·敏感性试验 | 第148页 |
·重复性试验 | 第148页 |
·pET 32a/DPV-gE-ELISA法检测DPV抗体的应用 | 第148页 |
3 结果 | 第148-153页 |
·重组蛋白pET 32a/DPV-gE纯化的检测结果 | 第148-149页 |
·pET 32a/DPV-gE-ELISA方法的建立 | 第149-152页 |
·最佳酶标二抗稀释度的检测结果 | 第149页 |
·最佳的包被抗原浓度及待检血清稀释度 | 第149-151页 |
·ELISA阴阳性临界值的判定标准 | 第151页 |
·特异性试验的检测结果 | 第151页 |
·敏感性试验的检测结果 | 第151-152页 |
·重复性试验的检测结果 | 第152页 |
·地方血清样品检测结果 | 第152-153页 |
4. 讨论 | 第153-155页 |
·包被抗原的选择 | 第153-154页 |
·基于重组蛋白pET 32a/DPV-gE建立间接ELISA方法检测DPV抗体的优化 | 第154-155页 |
5. 小结 | 第155-156页 |
Abstract | 第156-157页 |
结论 | 第157-159页 |
参考文献 | 第159-175页 |
致谢 | 第175-176页 |
作者简介 | 第176页 |