| 中文摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 符号说明 | 第11-12页 |
| 目录 | 第12-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-46页 |
| 1 猪流感病毒概述 | 第20-36页 |
| ·流行病学特点 | 第20-21页 |
| ·公共卫生意义 | 第21-22页 |
| ·猪流感病毒病原学及生物学特性 | 第22-23页 |
| ·猪流感分子生物学特征 | 第23-26页 |
| ·血凝素基因HA | 第23-24页 |
| ·神经氨酸酶基因NA | 第24页 |
| ·核蛋白基因NP | 第24-25页 |
| ·聚合酶基因PA、PB1、PB2 | 第25页 |
| ·基质蛋白基因M | 第25页 |
| ·非结构蛋白基因NS | 第25-26页 |
| ·猪流感病毒的抗原性变异 | 第26-27页 |
| ·猪流感病毒免疫学机制 | 第27-29页 |
| ·猪流感实验室诊断技术 | 第29-32页 |
| ·病毒分离 | 第29页 |
| ·血清学诊断 | 第29-31页 |
| ·分子生物学诊断 | 第31-32页 |
| ·猪流感新型疫苗的研究进展 | 第32-36页 |
| 2 M2疫苗研究进展 | 第36-41页 |
| ·M2e蛋白类疫苗 | 第37-39页 |
| ·M2e核酸疫苗 | 第39-40页 |
| ·M2e疫苗目前仍存在的机制争论及有待解决的问题 | 第40-41页 |
| ·广谱性的大小 | 第40-41页 |
| ·免疫反应类型的问题 | 第41页 |
| 3 核酸疫苗佐剂研究进展 | 第41-44页 |
| ·细胞因子佐剂 | 第42-43页 |
| ·蛋白转导类佐剂VP22 | 第43-44页 |
| 4 本研究的意义及目的 | 第44-46页 |
| 第二章 H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定 | 第46-79页 |
| 1 材料与方法 | 第46-59页 |
| ·实验材料 | 第46-47页 |
| ·病料及参考毒株 | 第46页 |
| ·鸡胚、细胞及载体 | 第46页 |
| ·主要试剂 | 第46-47页 |
| ·主要仪器及设备 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-59页 |
| ·病毒的分离及纯化 | 第47-49页 |
| ·病毒分离物的鉴定 | 第49-51页 |
| ·病毒特性研究 | 第51-52页 |
| ·动物回归试验 | 第52页 |
| ·流感病毒RT-PCR检测方法 | 第52-54页 |
| ·HA和NA基因序列分析 | 第54-59页 |
| 2 结果与分析 | 第59-74页 |
| ·病毒分离及传代 | 第59页 |
| ·外源病毒检测 | 第59-60页 |
| ·病毒血凝特性、特异性及亚型初步鉴定 | 第60页 |
| ·病毒命名 | 第60页 |
| ·病毒致MDCK细胞病变进程及病毒感染动力学 | 第60-62页 |
| ·病毒特性研究 | 第62页 |
| ·EID_(50)测定结果 | 第62页 |
| ·TCID_(50)测定结果 | 第62页 |
| ·病毒理化特性研究 | 第62-64页 |
| ·病毒感染力热稳定性试验结果 | 第62-63页 |
| ·乙醚敏感性试验结果 | 第63页 |
| ·氯仿敏感试验结果 | 第63-64页 |
| ·病毒核酸类型实验 | 第64页 |
| ·动物回归实验结果 | 第64-65页 |
| ·流感病毒RT-PCR检测方法的建立 | 第65-67页 |
| ·RT-PCR检测反应体系的建立及优化 | 第65-66页 |
| ·RT-PCR检测反应特异性研究 | 第66页 |
| ·RT-PCR检测反应敏感性研究 | 第66-67页 |
| ·临床样品的检测及与其它流感检测方法的比较 | 第67页 |
| ·HA和NA的RT-PCR扩增测序及序列分析 | 第67-74页 |
| ·HA和NA扩增测序 | 第67-69页 |
| ·HA和NA序列分析 | 第69-74页 |
| 3 讨论 | 第74-78页 |
| ·病毒的分离鉴定 | 第74-76页 |
| ·病毒生物学特性 | 第76页 |
| ·病毒遗传进化及分子特征 | 第76-78页 |
| 4 小结 | 第78-79页 |
| 第三章 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立 | 第79-91页 |
| 1 材料及方法 | 第79-83页 |
| ·实验材料 | 第79-81页 |
| ·病毒及血清 | 第79-80页 |
| ·菌株及质粒 | 第80页 |
| ·主要试剂 | 第80页 |
| ·主要仪器 | 第80页 |
| ·主要试剂的配制 | 第80-81页 |
| ·实验方法 | 第81-83页 |
| ·目的片段扩增及克隆 | 第81页 |
| ·NS1基因的生物信息学分析 | 第81页 |
| ·重组质粒的诱导表达及表达产物的检测 | 第81页 |
| ·表达产物的纯化及复性 | 第81-82页 |
| ·间接ELISA检测方法的建立 | 第82-83页 |
| 2 结果 | 第83-88页 |
| ·NS1的扩增与克隆、表达载体的构建 | 第83-84页 |
| ·NS1生物信息学分析 | 第84-85页 |
| ·诱导表达产物的SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定 | 第85-86页 |
| ·间接ELISA方法的建立 | 第86-88页 |
| ·抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度 | 第86-87页 |
| ·临界值的确定 | 第87页 |
| ·交叉反应 | 第87页 |
| ·竞争性抑制试验 | 第87-88页 |
| ·敏感性试验 | 第88页 |
| ·重复性试验 | 第88页 |
| 3 讨论 | 第88-90页 |
| ·NS1蛋白的血清学诊断 | 第88-89页 |
| ·原核表达及ELISA | 第89-90页 |
| 4 小结 | 第90-91页 |
| 第四章 M2e原、真核表达及生物活性研究 | 第91-116页 |
| 1 材料和方法 | 第91-105页 |
| ·实验材料 | 第91-92页 |
| ·毒株、细胞、菌株及载体 | 第91-92页 |
| ·主要试剂 | 第92页 |
| ·主要仪器 | 第92页 |
| ·实验方法 | 第92-105页 |
| ·猪流感病毒M2基因的扩增及TA克隆 | 第92-94页 |
| ·含3个MZe拷贝的MZe*3基因的获得 | 第94-97页 |
| ·M2e*3的原核表达 | 第97-101页 |
| ·原核表达M2e*3融合蛋白免疫原性研究 | 第101-102页 |
| ·M2e*3融合蛋白高免血清生物活性研究 | 第102页 |
| ·M2e*3的真核表达研究 | 第102-105页 |
| ·统计学方法 | 第105页 |
| 2 实验结果 | 第105-113页 |
| ·M2基因的克隆 | 第105-106页 |
| ·M2基因的RT-PCR扩增 | 第105-106页 |
| ·pMD19-T simple+M2的酶切鉴定 | 第106页 |
| ·M2基因测序鉴定 | 第106页 |
| ·M2e*3基因的获得 | 第106-108页 |
| ·M2e*2片段的扩增 | 第106-107页 |
| ·M2e*3片段的扩增 | 第107页 |
| ·pMD19-T simple+M2e*3 TA克隆的酶切及测序鉴定 | 第107-108页 |
| ·M2e*3基因的原核表达研究 | 第108-109页 |
| ·pET32-M2e*3质粒的鉴定 | 第108页 |
| ·M2e*3原核表达产物分析 | 第108-109页 |
| ·表达产物的纯化及Western-blotting分析 | 第109页 |
| ·M2e*3融合蛋白免疫原性研究 | 第109-110页 |
| ·Dot-ELISA测定M2e*3融合蛋白高免血清效价 | 第109页 |
| ·M2e*3融合蛋白高免血清识别M2天然蛋白的研究 | 第109-110页 |
| ·M2e*3融合蛋白高免血清生物活性研究 | 第110-112页 |
| ·M2e*3融合蛋白高免血清体外抑制病毒增殖生物活性检测 | 第110页 |
| ·M2e*3融合蛋白高免血清体内生物活性研究 | 第110-112页 |
| ·M2e*3真核表达研究 | 第112-113页 |
| ·M2e*3真核表达质粒pCI-M2e*3的构建 | 第112页 |
| ·M2e*3基因转录的RT-PCR检测 | 第112页 |
| ·M2e*3真核表达蛋白间接免疫荧光检测 | 第112-113页 |
| 3 讨论 | 第113-115页 |
| ·M2基因的扩增及M2e*3的构建 | 第113-114页 |
| ·三个M2e拷贝的选择 | 第114页 |
| ·原核表达M2e*3蛋白的免疫原性 | 第114-115页 |
| 4 小结 | 第115-116页 |
| 第五章 猪白介素18(IL-18)及伪狂犬VP22基因作为分子佐剂的初步研究 | 第116-136页 |
| 1 材料与方法 | 第117-123页 |
| ·实验材料 | 第117页 |
| ·载体、菌株、细胞及实验动物 | 第117页 |
| ·主要试剂 | 第117页 |
| ·主要仪器 | 第117页 |
| ·实验方法 | 第117-123页 |
| ·引物设计与合成 | 第117-118页 |
| ·pCI-IL18真核表达载体的构建 | 第118-119页 |
| ·pCI-IL18的真核转录表达研究 | 第119-120页 |
| ·pCI-IL18小鼠体内生物活性研究 | 第120页 |
| ·VP22的PCR扩增、克隆及序列分析 | 第120-121页 |
| ·pEGFP-N3+VP22E真核表达载体的构建及表达研究 | 第121-122页 |
| ·VP22作为分子佐剂的初步研究 | 第122-123页 |
| ·统计学方法 | 第123页 |
| 2 实验结果 | 第123-133页 |
| ·pCI-IL18真核表达载体的构建 | 第123-124页 |
| ·pCI-IL18真核转录及表达研究 | 第124-125页 |
| ·pCI-IL18小鼠体内生物活性 | 第125-126页 |
| ·VP22的扩增、克隆及序列分析 | 第126-129页 |
| ·pEGFP-N3+VP22E真核表达载体的构建及表达研究 | 第129-131页 |
| ·pEGFP-N3+VP22E的构建 | 第129页 |
| ·pEGFP-N3+VP22E的转录及表达 | 第129-131页 |
| ·VP22对HA重组质粒免疫效力的影响 | 第131-133页 |
| ·pCI-HA、pVP22-HA的构建 | 第131页 |
| ·pCI-HA、pVP22-HA的转录及表达研究 | 第131-132页 |
| ·pCI-HA、pVP22-HA诱导小鼠免疫反应 | 第132-133页 |
| 3 讨论 | 第133-135页 |
| 4 小结 | 第135-136页 |
| 第六章 M2e重组质粒免疫效力及工L-18和VP22作分子佐剂对其影响的研究 | 第136-158页 |
| 1 材料和方法 | 第136-142页 |
| ·实验材料 | 第136-137页 |
| ·毒株、菌株及载体 | 第136页 |
| ·实验动物 | 第136-137页 |
| ·主要试剂 | 第137页 |
| ·主要仪器 | 第137页 |
| ·实验方法 | 第137-142页 |
| ·引物的设计与合成 | 第137页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第137-138页 |
| ·重组真核表达载体在Vero细胞中的瞬时表达研究 | 第138-139页 |
| ·H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠的培育 | 第139页 |
| ·H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠株TCID_(50)及LD_(50)的测定 | 第139页 |
| ·重组质粒免疫效力及IL-18、VP22佐剂效应研究 | 第139-141页 |
| ·攻毒保护实验 | 第141-142页 |
| ·统计学方法 | 第142页 |
| 2 实验结果 | 第142-152页 |
| ·pM2e*3-IRES-IL18、pVP22-M2e*3的构建 | 第142页 |
| ·pM2e*3-IRES-IL18、pVP22-M2e*3的转录及表达研究 | 第142-144页 |
| ·H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠的培育 | 第144-145页 |
| ·H3N2亚型猪流感病毒小鼠适应株TCID_(50)和LD_(50)的测定 | 第145-146页 |
| ·重组质粒免疫效力研究 | 第146-149页 |
| ·体液免疫 | 第146-148页 |
| ·细胞免疫 | 第148-149页 |
| ·重组质粒免疫保护研究 | 第149-152页 |
| ·攻毒后存活率及体重变化 | 第149-151页 |
| ·免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 | 第151页 |
| ·对异源病毒攻击的保护 | 第151-152页 |
| 3 讨论 | 第152-156页 |
| ·双基因共表达载体的选用 | 第152页 |
| ·构建M2e*3序列的基础 | 第152-153页 |
| ·疫苗效果的评估标准 | 第153-154页 |
| ·pCI-M2e*3免疫效果的评估 | 第154-155页 |
| ·佐剂对免疫效果的影响 | 第155-156页 |
| 4 小结 | 第156-158页 |
| 第七章 M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究 | 第158-173页 |
| 1 材料及方法 | 第158-161页 |
| ·实验材料 | 第158-159页 |
| ·毒株、菌株及载体 | 第158页 |
| ·实验动物 | 第158页 |
| ·主要试剂 | 第158页 |
| ·主要仪器 | 第158-159页 |
| ·实验方法 | 第159-161页 |
| ·引物的设计与合成 | 第159页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第159页 |
| ·重组真核表达载体在Vero细胞中的转录表达研究 | 第159-160页 |
| ·重组质粒免疫效力研究 | 第160-161页 |
| ·攻毒保护实验 | 第161页 |
| ·统计学方法 | 第161页 |
| 2 实验结果 | 第161-169页 |
| ·pM2e*3-HA的构建 | 第161-162页 |
| ·pM2e*3-HA的转录及表达研究 | 第162-163页 |
| ·重组质粒免疫效力研究 | 第163-166页 |
| ·体液免疫 | 第163-165页 |
| ·细胞免疫 | 第165-166页 |
| ·重组质粒免疫保护研究 | 第166-169页 |
| ·攻毒后存活率及体重变化 | 第166-167页 |
| ·免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 | 第167-168页 |
| ·对异源病毒攻击的保护 | 第168-169页 |
| 3 讨论 | 第169-172页 |
| ·HA基因的选择 | 第169页 |
| ·HA和M2e基因的联用 | 第169-170页 |
| ·重组质粒的表达及免疫效果 | 第170-172页 |
| 4 小结 | 第172-173页 |
| 全文总结论 | 第173-174页 |
| 本研究的创新点 | 第174-175页 |
| 本研究的展望与建议 | 第175-176页 |
| 参考文献 | 第176-193页 |
| 致谢 | 第193-194页 |
| 个人简介 | 第194-195页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第195页 |
