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大肠杆菌产琥珀酸的代谢途径改造与调控研究

摘要第5-6页
ABSTRACT第6页
第1章 前言第11-20页
    1.1 琥珀酸的理化性质第11页
        1.1.1 琥珀酸的物理性质第11页
        1.1.2 琥珀酸的化学性质第11页
    1.2 琥珀酸的应用第11-12页
    1.3 琥珀酸的生产方法第12-14页
        1.3.1 化学合成法第12-13页
        1.3.2 生物合成法第13-14页
    1.4 产琥珀酸的主要菌株及其研究现状第14-16页
        1.4.1 产琥珀酸厌氧螺旋杆菌第14页
        1.4.2 产琥珀酸放线杆菌第14-15页
        1.4.3 曼海姆产琥珀酸杆菌第15页
        1.4.4 基因工程大肠杆菌第15-16页
    1.5 琥珀酸的分离与纯化第16页
        1.5.1 电渗析法第16页
        1.5.2 化学沉淀法第16页
        1.5.3 萃取法第16页
    1.6 磷酸戊糖途径第16-19页
        1.6.1 氧化性磷酸戊糖途径第17-18页
        1.6.2 非氧化性磷酸戊糖途径第18页
        1.6.3 磷酸戊糖途径的功能第18页
        1.6.4 对磷酸戊糖途径的研究第18-19页
    1.7 本课题的研究意义及主要研究内容第19-20页
        1.7.1 课题的研究意义第19页
        1.7.2 课题研究的主要内容第19-20页
第2章 大肠杆菌产琥珀酸的代谢途径改造第20-33页
    2.1 引言第20页
    2.2 实验材料第20-22页
        2.2.1 菌株与质粒第20-21页
        2.2.2 培养基第21页
        2.2.3 抗生素溶液第21页
        2.2.4 主要材料,试剂和设备第21-22页
    2.3 实验方法第22-26页
        2.3.1 实验流程第22-23页
        2.3.2 PCR引物设计第23页
        2.3.3 PCR扩增第23-24页
        2.3.4 PCR目的产物的胶回收与纯化第24页
        2.3.5 纯化后的DNA片段的酶切、回收第24-25页
        2.3.6 打靶片段的电击转化第25页
        2.3.7 PCR鉴定卡那抗生素抗性平板上阳性克隆第25-26页
        2.3.8 卡那霉素抗性片段的消除第26页
    2.4 结果与讨论第26-32页
        2.4.1 带靶基因同源臂的卡那霉素片段的扩增第26-28页
        2.4.2 带质粒pKD46的菌株的获得及质粒抽提验证第28-29页
        2.4.3 带同源臂的卡那霉素抗性片段与目的基因同源重组第29-31页
        2.4.4 转化质粒pCP20后,消除卡那霉素抗性片段第31-32页
    2.5 本章小结第32-33页
第3章 不同大肠杆菌发酵生产琥珀酸第33-48页
    3.1 引言第33页
    3.2 实验材料第33-35页
        3.2.1 菌种来源第33页
        3.2.2 培养基第33-34页
        3.2.3 实验仪器与设备第34-35页
        3.2.4 实验试剂第35页
    3.3 实验方法第35-42页
        3.3.1 一级种子培养第35页
        3.3.2 二级种子培养第35页
        3.3.3 摇瓶发酵实验方法第35-36页
        3.3.4 5-L罐两阶段的补料分批发酵第36页
        3.3.5 补料体积的确定第36-37页
        3.3.6 发酵产物的测定第37-41页
        3.3.7 葡萄糖测定方法第41-42页
    3.4 实验结果与讨论第42-47页
        3.4.1 野生型菌株以木糖为碳源两阶段摇瓶发酵实验第42页
        3.4.2 NZN111、MLB、CLB菌株的摇瓶发酵木糖效果比较第42-44页
        3.4.3 MLB菌株在5L罐发酵第44-45页
        3.4.4 MLBZ菌株在5L罐发酵第45页
        3.4.5 MLBZ在厌氧阶段添加碱式碳酸镁5L罐发酵第45-47页
    3.5 本章小结第47-48页
第4章 不同大肠杆菌发酵生产琥珀酸过程的调控分析第48-59页
    4.1 引言第48-49页
    4.2 实验材料第49页
        4.2.1 菌株第49页
        4.2.2 主要试剂第49页
    4.3 实验方法第49-54页
        4.3.1 鉴定PCR引物序列第49页
        4.3.2 菌体的培养方法与取样第49-50页
        4.3.3 实验流程第50页
        4.3.4 关键基因的引物设计第50-52页
        4.3.5 RNA的提取第52页
        4.3.6 RNA的变性第52-53页
        4.3.7 RNA的逆转录反应第53页
        4.3.8 RT-PCR反应第53-54页
    4.4 结果与讨论第54-58页
        4.4.1 ptsG是否突变鉴定结果第54页
        4.4.2 RNA浓度测定第54-55页
        4.4.3 RNA质量第55页
        4.4.4 RT-PCR中溶解曲线与扩增曲线与溶解曲线分析第55-57页
        4.4.5 MLB与MLBZ菌在对应条件下各基因的相对表达情况第57-58页
    4.5 本章小结第58-59页
第5章 结论与展望第59-61页
    5.1 结论第59-60页
    5.2 展望第60-61页
参考文献第61-66页
致谢第66页

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