| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第11-20页 |
| 1.1 琥珀酸的理化性质 | 第11页 |
| 1.1.1 琥珀酸的物理性质 | 第11页 |
| 1.1.2 琥珀酸的化学性质 | 第11页 |
| 1.2 琥珀酸的应用 | 第11-12页 |
| 1.3 琥珀酸的生产方法 | 第12-14页 |
| 1.3.1 化学合成法 | 第12-13页 |
| 1.3.2 生物合成法 | 第13-14页 |
| 1.4 产琥珀酸的主要菌株及其研究现状 | 第14-16页 |
| 1.4.1 产琥珀酸厌氧螺旋杆菌 | 第14页 |
| 1.4.2 产琥珀酸放线杆菌 | 第14-15页 |
| 1.4.3 曼海姆产琥珀酸杆菌 | 第15页 |
| 1.4.4 基因工程大肠杆菌 | 第15-16页 |
| 1.5 琥珀酸的分离与纯化 | 第16页 |
| 1.5.1 电渗析法 | 第16页 |
| 1.5.2 化学沉淀法 | 第16页 |
| 1.5.3 萃取法 | 第16页 |
| 1.6 磷酸戊糖途径 | 第16-19页 |
| 1.6.1 氧化性磷酸戊糖途径 | 第17-18页 |
| 1.6.2 非氧化性磷酸戊糖途径 | 第18页 |
| 1.6.3 磷酸戊糖途径的功能 | 第18页 |
| 1.6.4 对磷酸戊糖途径的研究 | 第18-19页 |
| 1.7 本课题的研究意义及主要研究内容 | 第19-20页 |
| 1.7.1 课题的研究意义 | 第19页 |
| 1.7.2 课题研究的主要内容 | 第19-20页 |
| 第2章 大肠杆菌产琥珀酸的代谢途径改造 | 第20-33页 |
| 2.1 引言 | 第20页 |
| 2.2 实验材料 | 第20-22页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第20-21页 |
| 2.2.2 培养基 | 第21页 |
| 2.2.3 抗生素溶液 | 第21页 |
| 2.2.4 主要材料,试剂和设备 | 第21-22页 |
| 2.3 实验方法 | 第22-26页 |
| 2.3.1 实验流程 | 第22-23页 |
| 2.3.2 PCR引物设计 | 第23页 |
| 2.3.3 PCR扩增 | 第23-24页 |
| 2.3.4 PCR目的产物的胶回收与纯化 | 第24页 |
| 2.3.5 纯化后的DNA片段的酶切、回收 | 第24-25页 |
| 2.3.6 打靶片段的电击转化 | 第25页 |
| 2.3.7 PCR鉴定卡那抗生素抗性平板上阳性克隆 | 第25-26页 |
| 2.3.8 卡那霉素抗性片段的消除 | 第26页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第26-32页 |
| 2.4.1 带靶基因同源臂的卡那霉素片段的扩增 | 第26-28页 |
| 2.4.2 带质粒pKD46的菌株的获得及质粒抽提验证 | 第28-29页 |
| 2.4.3 带同源臂的卡那霉素抗性片段与目的基因同源重组 | 第29-31页 |
| 2.4.4 转化质粒pCP20后,消除卡那霉素抗性片段 | 第31-32页 |
| 2.5 本章小结 | 第32-33页 |
| 第3章 不同大肠杆菌发酵生产琥珀酸 | 第33-48页 |
| 3.1 引言 | 第33页 |
| 3.2 实验材料 | 第33-35页 |
| 3.2.1 菌种来源 | 第33页 |
| 3.2.2 培养基 | 第33-34页 |
| 3.2.3 实验仪器与设备 | 第34-35页 |
| 3.2.4 实验试剂 | 第35页 |
| 3.3 实验方法 | 第35-42页 |
| 3.3.1 一级种子培养 | 第35页 |
| 3.3.2 二级种子培养 | 第35页 |
| 3.3.3 摇瓶发酵实验方法 | 第35-36页 |
| 3.3.4 5-L罐两阶段的补料分批发酵 | 第36页 |
| 3.3.5 补料体积的确定 | 第36-37页 |
| 3.3.6 发酵产物的测定 | 第37-41页 |
| 3.3.7 葡萄糖测定方法 | 第41-42页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第42-47页 |
| 3.4.1 野生型菌株以木糖为碳源两阶段摇瓶发酵实验 | 第42页 |
| 3.4.2 NZN111、MLB、CLB菌株的摇瓶发酵木糖效果比较 | 第42-44页 |
| 3.4.3 MLB菌株在5L罐发酵 | 第44-45页 |
| 3.4.4 MLBZ菌株在5L罐发酵 | 第45页 |
| 3.4.5 MLBZ在厌氧阶段添加碱式碳酸镁5L罐发酵 | 第45-47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-48页 |
| 第4章 不同大肠杆菌发酵生产琥珀酸过程的调控分析 | 第48-59页 |
| 4.1 引言 | 第48-49页 |
| 4.2 实验材料 | 第49页 |
| 4.2.1 菌株 | 第49页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第49页 |
| 4.3 实验方法 | 第49-54页 |
| 4.3.1 鉴定PCR引物序列 | 第49页 |
| 4.3.2 菌体的培养方法与取样 | 第49-50页 |
| 4.3.3 实验流程 | 第50页 |
| 4.3.4 关键基因的引物设计 | 第50-52页 |
| 4.3.5 RNA的提取 | 第52页 |
| 4.3.6 RNA的变性 | 第52-53页 |
| 4.3.7 RNA的逆转录反应 | 第53页 |
| 4.3.8 RT-PCR反应 | 第53-54页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第54-58页 |
| 4.4.1 ptsG是否突变鉴定结果 | 第54页 |
| 4.4.2 RNA浓度测定 | 第54-55页 |
| 4.4.3 RNA质量 | 第55页 |
| 4.4.4 RT-PCR中溶解曲线与扩增曲线与溶解曲线分析 | 第55-57页 |
| 4.4.5 MLB与MLBZ菌在对应条件下各基因的相对表达情况 | 第57-58页 |
| 4.5 本章小结 | 第58-59页 |
| 第5章 结论与展望 | 第59-61页 |
| 5.1 结论 | 第59-60页 |
| 5.2 展望 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
