| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 主要符号表 | 第14-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-26页 |
| 1.1 有机磷水解酶研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.1 有机磷水解酶的研究概况 | 第15-16页 |
| 1.2.2 有机磷水解酶的来源及分布 | 第16页 |
| 1.2.3 甲基对硫磷水解酶的作用机理 | 第16-17页 |
| 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第17-22页 |
| 1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 | 第17-19页 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达载体和菌株 | 第19-20页 |
| 1.3.3 提高外源蛋白表达量优化策略 | 第20-22页 |
| 1.3 酶的固定化方法 | 第22-24页 |
| 1.3.0 固定化酶的应用 | 第22-23页 |
| 1.3.1 固定化酶的特点 | 第23-24页 |
| 1.3.2 固定化载体的选择 | 第24页 |
| 1.4 本文的研究目的及意义 | 第24-26页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第26-47页 |
| 2.1 材料 | 第26-33页 |
| 2.1.1 菌株 | 第26页 |
| 2.1.2 培养基 | 第26-27页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.4 仪器及相关设备 | 第28-29页 |
| 2.1.5 实验室主要溶液成分及配制方法 | 第29-30页 |
| 2.1.6 PCR引物 | 第30-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-47页 |
| 2.2.1 mph-R基因设计及全基因合成 | 第33-35页 |
| 2.2.2 PCR产物纯化回收 | 第35页 |
| 2.2.3 酶切处理pHBM905BDM载体 | 第35-36页 |
| 2.2.4 T4 DNA聚合酶作削Overlapping PCR产物 | 第36页 |
| 2.2.5 SDS碱裂解法提取质粒DNA | 第36-37页 |
| 2.2.6 大肠杆菌XL10-Gold感受态的制备及其转化方法 | 第37-38页 |
| 2.2.7 毕赤酵母GS115感受态的制备及其转化方法 | 第38页 |
| 2.2.8 毕赤酵母细胞快速提取基因组的方法 | 第38-39页 |
| 2.2.9 构建重组表达载体pHBM905BDM-mph-R | 第39-40页 |
| 2.2.10 甲基对硫磷MPH-R在毕赤酵母GS115中的鉴定和表达 | 第40页 |
| 2.2.11 Bradford法测定蛋白浓度 | 第40-41页 |
| 2.2.12 蛋白质纯化步骤 | 第41-42页 |
| 2.2.13 MPH-R酶活检测及酶学性质分析 | 第42-44页 |
| 2.2.14 MPH-R在发酵罐中的表达 | 第44页 |
| 2.2.15 壳聚糖固定化MPH-R | 第44-47页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第47-64页 |
| 3.1 甲基对硫磷水解酶mph-R全基因合成 | 第47-49页 |
| 3.1.1 在线软件分析原始mph信号肽序列 | 第47页 |
| 3.1.2 优化序列与原始序列同源性对比 | 第47-49页 |
| 3.1.3 mph-R全基因合成 | 第49页 |
| 3.2 重组表达载体pHBM905BDM-mph-R的构建 | 第49-50页 |
| 3.3 有机磷水解酶在毕赤酵母中的表达和鉴定 | 第50-51页 |
| 3.4 重组甲基对硫磷水解酶MPH-R酶学性质分析 | 第51-57页 |
| 3.4.1 温度对MPH-R酶活的影响 | 第51-53页 |
| 3.4.2 pH对MPH-R酶活的影响 | 第53-54页 |
| 3.4.3 不同金属离子对MPH-R酶活的影响 | 第54-55页 |
| 3.4.4 MPH-R的糖基化分析 | 第55-57页 |
| 3.5 MPH-R在发酵罐中的表达 | 第57-59页 |
| 3.6 壳聚糖固定化MPH-R | 第59-64页 |
| 3.6.1 固定化MPH-R蛋白质含量的测定 | 第59页 |
| 3.6.2 温度对固定化MPH-R酶活的影响 | 第59-60页 |
| 3.6.3 固定化MPH-R的热稳定性 | 第60-61页 |
| 3.6.4 pH对固定化MPH-R酶活的影响 | 第61页 |
| 3.6.5 固定化MPH-R的pH稳定性 | 第61-62页 |
| 3.6.6 固定化MPH-R的重复使用率 | 第62-64页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第64-67页 |
| 4.1 讨论 | 第64-65页 |
| 4.1.1 甲基对硫磷水解酶MPH-R在毕赤酵母中的表达 | 第64-65页 |
| 4.1.2 壳聚糖固定化MPH-R的理化性质研究 | 第65页 |
| 4.2 展望 | 第65-67页 |
| 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
