| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-21页 |
| 第一部分 前言 | 第21-42页 |
| 1 巴西橡胶树棒孢霉落叶病研究综述 | 第21-25页 |
| ·我国巴西橡胶树产业的经济、社会和生态重要性 | 第21页 |
| ·巴西橡胶树棒孢霉落叶病研究概况 | 第21-25页 |
| ·分布与为害 | 第21-22页 |
| ·症状特征 | 第22页 |
| ·病菌学 | 第22-24页 |
| ·分类 | 第22-23页 |
| ·形态 | 第23页 |
| ·生物学特性 | 第23-24页 |
| ·发生流行规律 | 第24页 |
| ·品种抗病性 | 第24页 |
| ·气象条件 | 第24页 |
| ·海拔 | 第24页 |
| ·土壤肥力 | 第24页 |
| ·防治 | 第24-25页 |
| ·选用抗病品种 | 第25页 |
| ·药剂防治 | 第25页 |
| ·其他防治措施 | 第25页 |
| 2 植物病原真菌MAPK胞外信号转导途径研究进展 | 第25-35页 |
| ·参与调控环境胁迫反应 | 第29-30页 |
| ·参与调控有性交配 | 第30-31页 |
| ·参与调控菌丝和孢子生长发育 | 第31页 |
| ·参与调控病菌的致病性 | 第31-35页 |
| ·PMK1类基因 | 第32-33页 |
| ·MPS1类基因 | 第33-35页 |
| 3 植物病原真菌毒素研究进展 | 第35-38页 |
| ·植物病原真菌毒素种类 | 第35页 |
| ·植物病原真菌毒素作用位点 | 第35页 |
| ·植物病原真菌毒素提纯与活性测定 | 第35-36页 |
| ·植物病原真菌毒素分子遗传研究 | 第36-38页 |
| ·毒素的遗传研究 | 第36-37页 |
| ·HST毒素遗传研究 | 第36-37页 |
| ·NHST毒素遗传研究 | 第37页 |
| ·毒素产生的调控研究 | 第37-38页 |
| 4. 多主棒孢菌分子生物学研究概况 | 第38-39页 |
| ·分子检测 | 第38页 |
| ·分子遗传多样性 | 第38页 |
| ·cassiicolin毒素分子特征 | 第38-39页 |
| 5 本研究的目的意义和主要研究内容 | 第39-42页 |
| ·目的意义 | 第39-40页 |
| ·主要研究内容 | 第40页 |
| ·主要技术路线 | 第40-42页 |
| 第二部分 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌蛋白激酶基因(CCK1)的克隆、敲除及表型测定 | 第42-89页 |
| 1.材料与方法 | 第42-63页 |
| ·材料与仪器 | 第42-43页 |
| ·供试药剂及试剂 | 第42页 |
| ·供试培养基 | 第42页 |
| ·供试病原菌 | 第42页 |
| ·主要仪器 | 第42-43页 |
| ·病原菌的纯化 | 第43页 |
| ·蛋白激酶基因CCK1片段的扩增 | 第43-45页 |
| ·病原菌基因组DNA的提取 | 第43-44页 |
| ·蛋白激酶CCK1基因片段扩增 | 第44-45页 |
| ·引物设计 | 第44页 |
| ·PCR体系与程序 | 第44页 |
| ·CCK1片段的回收、克隆、测序与分析 | 第44-45页 |
| ·SEFA-PCR扩增获得蛋白激酶基因CCK1的DNA全长 | 第45-47页 |
| ·引物设计 | 第45-46页 |
| ·SEFA-PCR第一步扩增 | 第46页 |
| ·SEFA-PCR第二步扩增 | 第46-47页 |
| ·扩增产物电泳检测 | 第47页 |
| ·5′端和3′端第二轮扩增产物的回收、连接、转化和克隆检测 | 第47页 |
| ·5′端和3′端序列的测定与拼接 | 第47页 |
| ·CCK1全长DNA序列验证 | 第47页 |
| ·CCK1全长DNA序列分析 | 第47页 |
| ·蛋白激酶基因CCK1基因全长cDNA序列的获得 | 第47-49页 |
| ·菌丝总RNA的提取 | 第47-48页 |
| ·CCK1基因的cDNA的获得 | 第48-49页 |
| ·cDNA的回收、克隆和测序 | 第49页 |
| ·CCK1序列分析 | 第49页 |
| ·蛋白激酶基因CCK1基因的敲除 | 第49-60页 |
| ·CCK1基因敲除载体的构建 | 第50-54页 |
| ·CCK1基因5′端DVF片段和3′端DVB片段的扩增与克隆 | 第50页 |
| ·pDVF质粒提取 | 第50-51页 |
| ·酶切pDVF载体 | 第51页 |
| ·构建起始敲除载体pDVFB | 第51页 |
| ·去磷酸化线形载体pDVFB制备 | 第51-52页 |
| ·潮霉素B抗性基因(hygB)的扩增与回收 | 第52-53页 |
| ·敲除载体pFHB的构建 | 第53-54页 |
| ·CCK1基因敲除 | 第54-56页 |
| ·CC004菌株对潮霉素B(Hm B)的敏感性测定 | 第54页 |
| ·病原菌原生质体制备 | 第54-55页 |
| ·原生质体转化与再生 | 第55-56页 |
| ·CCK1敲除突变体的筛选与PCR验证 | 第56-57页 |
| ·转化子纯化 | 第56页 |
| ·用鉴定多主棒孢菌的特异性引物扩增鉴定突变体 | 第56页 |
| ·用特异性引物和扩增潮霉素的引物扩增验证突变体 | 第56-57页 |
| ·CCK1突变体FHB4的Southern杂交分析 | 第57-60页 |
| ·蛋白激酶基因CCK1突变体FHB4表型测定 | 第60-63页 |
| ·突变体FHB4对潮霉素抗性的遗传稳定性检测 | 第60页 |
| ·突变体FHB4菌落、菌丝形态情况观察 | 第60页 |
| ·突变体FHB4产孢情况观察 | 第60页 |
| ·CCK1突变体FHB4对温度、酸碱度、渗透胁迫和农药敏感性测定 | 第60-61页 |
| ·生长温度范围的测定 | 第60页 |
| ·致死温度的测定 | 第60-61页 |
| ·对pH敏感性测定 | 第61页 |
| ·对高渗胁迫条件的敏感性测定 | 第61页 |
| ·对农药敏感性测定 | 第61页 |
| ·CCK1突变体FHB4致病性测定 | 第61-62页 |
| ·CFK1突变体FHB4菌株菌饼致病性测定 | 第61-62页 |
| ·CCK1突变体FHB4粗毒素致病性测定 | 第62页 |
| ·CCK1突变体FHB4产酶活性的测定 | 第62-63页 |
| ·漆酶相对产量的测定 | 第62页 |
| ·细胞壁降解酶活性测定 | 第62-63页 |
| ·CCK1途径与其他信号转导途径的关系初探 | 第63页 |
| ·CCK1途径与钙信号途径间的关系 | 第63页 |
| ·CCK1途径与cAMP途径间的关系 | 第63页 |
| 2 结果与分析 | 第63-87页 |
| ·蛋白激酶基因CCK1片段的扩增 | 第63-65页 |
| ·病原菌基因组DNA的提取 | 第63-64页 |
| ·蛋白激酶CCK1基因片段扩增结果 | 第64-65页 |
| ·SEFA-PCR扩增获得蛋白激酶基因CCK1的DNA全长 | 第65-66页 |
| ·蛋白激酶基因CCK1基因全长cDNA序列的获得 | 第66-67页 |
| ·CCK1基因全长cDNA的扩增和测序结果 | 第66-67页 |
| ·蛋白激酶CCK1基因序列分析 | 第67-70页 |
| ·CCK1基因全长DNA与cDNA序列分析 | 第67-68页 |
| ·CCK1基因预测蛋白的可能性结构与功能性分析 | 第68-70页 |
| ·CCK1推测蛋白的相似性分析 | 第68-70页 |
| ·CCK1基因推测蛋白保守结构域分析 | 第70页 |
| ·蛋白激酶基因CCK1基因的敲除 | 第70-75页 |
| ·CCK1基因敲除载体的构建 | 第70-72页 |
| ·CCK1基因5′端DVF和3′端DVB片段的扩增与克隆 | 第70-71页 |
| ·潮霉素B抗性基因(hygB)的扩增 | 第71-72页 |
| ·敲除载体pFHB的生成 | 第72页 |
| ·CCK1基因敲除 | 第72-73页 |
| ·巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌菌株对潮霉素(Hm B)的敏感性 | 第72页 |
| ·病原菌原生质体的制备 | 第72-73页 |
| ·用于CCK1基因敲除的FHB基因片段的扩增 | 第73页 |
| ·CCK1基因敲除 | 第73页 |
| ·CCK1敲除突变体的筛选与PCR验证 | 第73-74页 |
| ·用鉴定多主棒孢菌的特异性引物扩增鉴定转化子 | 第73页 |
| ·用特异性引物和扩增潮霉素的引物扩增验证转化子 | 第73-74页 |
| ·CCK1突变体FHB4的Southern杂交分析 | 第74-75页 |
| ·蛋白激酶CCK1突变体FHB4表型测定 | 第75-87页 |
| ·CCK1突变体FHB4对潮霉素抗性的遗传稳定性检测 | 第75页 |
| ·CCK1突变体FHB4菌落、菌丝形态、产孢情况观察 | 第75-77页 |
| ·突变体FHB4菌落形态观察和生长速率测定 | 第75-76页 |
| ·突变体FHB4菌丝形态观察 | 第76-77页 |
| ·突变体FHB4产孢情况观察 | 第77页 |
| ·CCK1突变体FHB4对温度、酸碱度、渗透胁迫敏感性测定 | 第77-81页 |
| ·生长温度范围的测定 | 第77-78页 |
| ·菌丝致死温度的测定 | 第78页 |
| ·对pH敏感性测定 | 第78页 |
| ·对高渗胁迫条件的敏感性测定 | 第78-80页 |
| ·对农药敏感性测定 | 第80-81页 |
| ·CCK1突变体FHB4致病性测定 | 第81-84页 |
| ·菌饼致病性测定 | 第81-82页 |
| ·粗毒素致病性测定 | 第82-84页 |
| ·CCK1突变体酶活性测定 | 第84-86页 |
| ·漆酶相对产量的测定 | 第84-85页 |
| ·细胞壁降解酶活性测定 | 第85-86页 |
| ·CCK1途径与其他信号转导途径的关系初探 | 第86-87页 |
| ·CCK1途径与钙信号途径间的关系 | 第86页 |
| ·CCK1途径与cAMP途径间的关系 | 第86-87页 |
| 3 小结 | 第87-89页 |
| 第三部分 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素基因(ct)的克隆、敲除及表型测定 | 第89-111页 |
| 1.材料与方法 | 第89-95页 |
| ·材料与仪器 | 第89页 |
| ·病原菌基因组DNA的提取 | 第89页 |
| ·毒素ct基因片段的扩增、克隆和分析 | 第89页 |
| ·引物设计 | 第89页 |
| ·ct基因片段的扩增 | 第89页 |
| ·ct片段的凝胶回收、克隆、测序与分析 | 第89页 |
| ·SEFA-PCR扩增获得毒素基因ct的DNA全长 | 第89-90页 |
| ·引物设计 | 第89-90页 |
| ·SEFA-PCR第一步、第二步扩增 | 第90页 |
| ·第二轮扩增产物测序引物设计 | 第90页 |
| ·5′端和3′端序列拼接 | 第90页 |
| ·ct基因全长DNA序列验证 | 第90页 |
| ·ct基因DNA序列分析 | 第90页 |
| ·毒素基因ct基因全长cDNA序列的获得 | 第90-91页 |
| ·菌丝总RNA的提取 | 第90页 |
| ·ct基因的cDNA的获得 | 第90-91页 |
| ·ct基因的cDNA的回收、克隆和测序 | 第91页 |
| ·ct基因cDNA序列分析 | 第91页 |
| ·毒素基因ct的敲除 | 第91-94页 |
| ·ct基因敲除载体的构建 | 第92页 |
| ·pCT质粒提取 | 第92页 |
| ·酶切pCT载体 | 第92页 |
| ·去磷酸化线形载体pCT制备 | 第92页 |
| ·潮霉素B抗性基因(hygB)的扩增与回收 | 第92页 |
| ·敲除载体pCTH的构建 | 第92页 |
| ·ct基因敲除 | 第92-93页 |
| ·ct敲除突变体的筛选与PCR验证 | 第93页 |
| ·转化子纯化 | 第93页 |
| ·转化子的PCR验证 | 第93页 |
| ·毒素突变体CTH5的Southern杂交分析 | 第93-94页 |
| ·毒素突变体CTH5表型测定 | 第94-95页 |
| ·突变体CTH5对潮霉素抗性的遗传稳定性检测 | 第94页 |
| ·毒素突变体CTH5菌落、菌丝形态、产孢和孢子萌发情况观察 | 第94页 |
| ·毒素突变体CTH5 | 第94页 |
| ·生长温度范围的测定 | 第94页 |
| ·致死温度的测定 | 第94页 |
| ·对pH敏感性测定 | 第94页 |
| ·毒素突变体CTH5致病性测定 | 第94-95页 |
| ·菌饼致病性测定 | 第95页 |
| ·粗毒素致病性测定 | 第95页 |
| ·毒素突变体CTH5酶活性的测定 | 第95页 |
| ·漆酶相对产量的测定 | 第95页 |
| ·纤维素酶相对产量的测定 | 第95页 |
| 2 结果与分析 | 第95-109页 |
| ·ct基因片段扩增、克隆和测序结果 | 第95页 |
| ·SEFA-PCR扩增获得毒素基因ct的DNA全长 | 第95-97页 |
| ·ct基因全长cDNA获得及序列分析 | 第97-98页 |
| ·毒素ct基因序列分析 | 第98-99页 |
| ·ct基因全长DNA与cDNA序列分析 | 第98页 |
| ·毒素ct基因推测蛋白的序列分析 | 第98-99页 |
| ·毒素基因ct的敲除 | 第99-102页 |
| ·潮霉素B抗性基因(hygB)的扩增 | 第99-100页 |
| ·敲除载体pCTH的构建 | 第100页 |
| ·ct基因敲除 | 第100页 |
| ·用于ct基因敲除的CTH片段的扩增 | 第100页 |
| ·ct基因敲除 | 第100页 |
| ·ct敲除突变体的PCR验证 | 第100-101页 |
| ·ct突变体CTH5的Southern杂交分析 | 第101-102页 |
| ·毒素突变体CTH5表型测定 | 第102-109页 |
| ·毒素突变体CTH5对潮霉素抗性的遗传稳定性检测 | 第102页 |
| ·毒素突变体CTH5菌落和菌丝形态、产孢和孢子萌发情况观察 | 第102-104页 |
| ·毒素突变体CTH5对温度、酸碱度敏感性测定 | 第104-105页 |
| ·生长温度范围的测定 | 第104-105页 |
| ·致死温度测定 | 第105页 |
| ·对pH敏感性测定 | 第105页 |
| ·毒素突变体CTH5致病性测定 | 第105-108页 |
| ·菌饼致病性测定 | 第105-106页 |
| ·粗毒素致病性测定 | 第106-108页 |
| ·毒素突变体CTH5产酶活性的测定 | 第108-109页 |
| ·漆酶相对产量的测定 | 第108-109页 |
| ·纤维素酶相对产量的测定 | 第109页 |
| 3 小结 | 第109-111页 |
| 第四部分 结论、讨论及展望 | 第111-120页 |
| 1 主要结论 | 第111-113页 |
| ·获得巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌蛋白激酶基因CCK1分析 | 第111页 |
| ·获得巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌蛋白激酶CCK1基因敲除突变体 | 第111页 |
| ·测定了蛋白激酶CCK1基因突变体FHB4表型 | 第111-112页 |
| ·获得巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素基因ct序列 | 第112页 |
| ·获得巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素ct基因敲除突变体 | 第112页 |
| ·测定了毒素基因突变体CTH5表型 | 第112-113页 |
| 2 讨论 | 第113-117页 |
| ·蛋白激酶CCK1序列表型分析 | 第113-114页 |
| ·蛋白激酶CCK1突变体和毒素突变体致病性比较分析 | 第114-115页 |
| ·CCK1蛋白激酶调控途径与其他调控途径关系 | 第115-116页 |
| ·毒素基因分析 | 第116页 |
| ·SEFA-PCR法的改进 | 第116-117页 |
| ·敲除载体构建方法的改进 | 第117页 |
| ·突变体纯化方法的改进 | 第117页 |
| 3. 本研究创新点 | 第117-118页 |
| 4. 后续研究 | 第118-120页 |
| 参考文献 | 第120-134页 |
| 附录1 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌蛋白激酶CCK1基因DNA与cDNA序列比对 | 第134-137页 |
| 附录2 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌CCK1基因全序列登录页面 | 第137-140页 |
| 附录3 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌CCK1与其他菌物PMK1类MAPK同源基因的氨基酸序列相似性比对 | 第140-142页 |
| 附录4 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素ct基因DNA与cDNA序列比对 | 第142-145页 |
| 附录5 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素ct基因全序列登录页面 | 第145-147页 |
| 附录6 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素基因ct与cas的DNA序列(ATG-TAA)相似性比对 | 第147-148页 |
| 附录7 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌毒素基因ct与cas的cDNA序列相似性比对 | 第148-149页 |
| 攻读博士期间发表的研究论文、获奖及编写教材情况 | 第149-151页 |
| 致谢 | 第151页 |
