| 摘要 | 第2-3页 |
| abstract | 第3-4页 |
| 引言 | 第8-10页 |
| 1 材料 | 第10-12页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第10页 |
| 1.2 培养基 | 第10-11页 |
| 1.2.1 LB平板（w/v） | 第10页 |
| 1.2.2 ALB平板（w/v） | 第10页 |
| 1.2.3 CLB平板（w/v） | 第10页 |
| 1.2.4 SCLB平板（w/v） | 第10页 |
| 1.2.5 TCLB平板（w/v） | 第10-11页 |
| 1.2.6 蔗糖平板 （w/v） | 第11页 |
| 1.2.7 牛肉膏蛋白胨培养基（w/v） | 第11页 |
| 1.2.8 LB液体培养基 | 第11页 |
| 1.3 主要试剂 | 第11页 |
| 1.4 主要仪器 | 第11-12页 |
| 2 方法 | 第12-24页 |
| 2.1 嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株基因组DNA的提取 | 第12-13页 |
| 2.2 嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统E基因突变株的构建 | 第13-20页 |
| 2.2.1 突变株ΔgspE的PCR引物设计： | 第13-14页 |
| 2.2.2 GspE基因的上下游同源臂以及氯霉素基因的PCR扩增（以ΔgspE为例） | 第14-15页 |
| 2.2.3 PCR产物的纯化 | 第15-16页 |
| 2.2.4 E基因上下游同源臂及cat基因进行SOE-PCR | 第16页 |
| 2.2.5 SOE-PCR产物切胶回收 | 第16页 |
| 2.2.6 大量制备SOE-PCR融合片段 | 第16-18页 |
| 2.2.7 重组质粒提取 | 第18页 |
| 2.2.8 重组质粒的酶切鉴定 | 第18-19页 |
| 2.2.9 重组质粒测序分析 | 第19页 |
| 2.2.10 重组质粒和自杀质粒pEX18Tc进行大量双酶切 | 第19-20页 |
| 2.2.11 自杀质粒pEX-18Tc和目的片段切胶回收 | 第20页 |
| 2.3 构建重组自杀质粒 | 第20-22页 |
| 2.3.1 将纯化后的目的片段与自杀质粒连接 | 第20页 |
| 2.3.2 重组自杀质粒的转化 | 第20-21页 |
| 2.3.3 重组自杀质粒的提取 | 第21页 |
| 2.3.4 重组自杀质粒的酶切鉴定及测序 | 第21页 |
| 2.3.5 接合转移 | 第21-22页 |
| 2.4 基因突变株的PCR鉴定 | 第22-23页 |
| 2.4.1 突变株的基因组提取 | 第22页 |
| 2.4.2 鉴定使用引物 | 第22-23页 |
| 2.5 各突变株和野生株D2的蛋白分泌检测 | 第23-24页 |
| 2.5.1 制备蛋白样品 | 第23页 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳 | 第23-24页 |
| 2.6 基因敲除后突变株和野生株的生长情况观察 | 第24页 |
| 3 结果 | 第24-36页 |
| 3.1 GspE基因上下游序列测序 | 第24-28页 |
| 3.1.1 E基因上下游序列PCR扩增 | 第24-25页 |
| 3.1.2 E基因上下游与 18T载体连接后酶切鉴定结果 | 第25页 |
| 3.1.3 E上游基因测序后与E基因及下游基因的拼接结果 | 第25-28页 |
| 3.2 构建突变株ΔgspE | 第28-32页 |
| 3.2.1 E基因上下游同源臂以及cat片段PCR扩增结果 | 第28-29页 |
| 3.2.2 SOE-PCR结果 | 第29-30页 |
| 3.2.3 重组质粒提取及酶切结果 | 第30页 |
| 3.2.4 PCR水煮模板法筛选出突变株后鉴定结果 | 第30页 |
| 3.2.5 SOE片段测序结果（2008bp，有下划线的序列为插入序列） | 第30-32页 |
| 3.3 XpsE基因敲除及两套Ⅱ型分泌系统E基因同时敲除 | 第32-35页 |
| 3.3.1 D、F片段以及SOEPCR扩增结果 | 第32-33页 |
| 3.3.2 重组质粒提取及酶切鉴定结果 | 第33页 |
| 3.3.3 水煮模板法筛选出突变株后PCR鉴定结果 | 第33-34页 |
| 3.3.4 D+F片段测序结果（1652bp，无插入序列） | 第34-35页 |
| 3.4 野生株和突变株的SDS-PAGE结果 | 第35-36页 |
| 3.5 D2野生株与各突变株生长情况的比较 | 第36页 |
| 4 讨论 | 第36-40页 |
| 5 结论 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-43页 |
| 6 主成分分析方法在微生物分类识别中的应用研究 | 第43-48页 |
| 6.1 引言 | 第43-44页 |
| 6.2 数据处理 | 第44页 |
| 6.3 结果与分析 | 第44-47页 |
| 6.4 讨论 | 第47页 |
| 参考文献 | 第47-48页 |
| 综述 | 第48-60页 |
| 1 革兰氏阴性细菌的分泌系统的概述 | 第48-49页 |
| 2 Ⅱ型分泌系统 | 第49-52页 |
| 3 基因敲除技术 | 第52-57页 |
| 参考文献 | 第57-60页 |
| 攻读学位期间研究成果 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
