| 中文摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 一 前言 | 第7-9页 |
| 1.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术 | 第7页 |
| 1.2 ATRX基因与端粒的替代延长机制 | 第7-9页 |
| 二 实验内容 | 第9-10页 |
| 三 实验内容流程图 | 第10-11页 |
| 四 实验方法 | 第11-19页 |
| 4.1 构建识别ATRX基因目标序列的sgRNA重组载体(pLenti-sgRNA-Lib) | 第11-13页 |
| 4.2 慢病毒滴度测定方法(流式细胞仪计数法) | 第13页 |
| 4.3 细胞培养相关实验方法 | 第13-14页 |
| 4.4 细胞感染实验方法 | 第14-15页 |
| 4.5 HeLa单克隆细胞分选方法 | 第15页 |
| 4.6 T7核酸内切酶Ⅰ(T7 Endonuclease I,T7E1)酶切实验方法 | 第15页 |
| 4.7 ATRX基因sgRNA切割位点Sanger测序 | 第15-16页 |
| 4.8 BCA方法测定蛋白浓度 | 第16-17页 |
| 4.9 Western-blot实验方法 | 第17-19页 |
| 五 实验仪器、试剂和材料 | 第19-26页 |
| 5.1 质粒载体 | 第19-21页 |
| 5.2 感受态菌株 | 第21页 |
| 5.3 细胞 | 第21页 |
| 5.4 细胞培养试剂 | 第21页 |
| 5.5 PCR主要试剂 | 第21页 |
| 5.6 Western-blot主要试剂 | 第21-22页 |
| 5.7 主要试剂盒 | 第22页 |
| 5.8 主要仪器设备 | 第22页 |
| 5.9 主要溶剂配方 | 第22-23页 |
| 5.10 5组ATRX基因sgRNA目标序列 | 第23-24页 |
| 5.11 根据5组ATRX基因SgRNA目标序列设汁合成的SgRNA接头序列 | 第24页 |
| 5.12 T7E1实验PCR扩增ATRX目标序列的引物 | 第24-26页 |
| 六 结果与分析 | 第26-36页 |
| 6.1 sgRNA重组载体测序结果 | 第26-29页 |
| 6.2 慢病毒颗粒滴度检测结果 | 第29页 |
| 6.3 sgRNA重组载体感染HeLa细胞的荧光显微镜观察照片 | 第29-32页 |
| 6.4 T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验结果 | 第32-33页 |
| 6.5 Western-blot鉴定ATRX蛋白表达水平的实验结果 | 第33-34页 |
| 6.6 编号 | 第34-36页 |
| 七 讨论 | 第36-39页 |
| 7.1 关于ATRX基因靶序列的选择 | 第36页 |
| 7.2 识别ATRX基因目标序列的sgRNA重组载体的构建 | 第36页 |
| 7.3 sgRNA重组慢病毒载体感染细胞 | 第36-37页 |
| 7.4 T7E1实验巧步鉴定5组SgRNA介导的CRISPR/Cas9系统对ATRX目标序列的切割效率 | 第37-38页 |
| 7.5 Western-blot在蛋白水平鉴定ATRX敲除 | 第38页 |
| 7.6 Sanger测序在DNA水平分析ATRX突变机制 | 第38页 |
| 7.7 对进一步研究的展望 | 第38-39页 |
| 八 参考文献 | 第39-41页 |
| 综述：CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展与应用 | 第41-48页 |
| 参考文献 | 第46-48页 |
| 综述：ATRX基因与端粒的替代延长机制 | 第48-53页 |
| 参考文献 | 第50-53页 |
| 致谢 | 第53-54页 |
