嗜冷杆菌Psychrobacter sp.的冷活性、耐盐酯酶基因的克隆、蛋白表达及其酶学性质研究
| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-32页 |
| ·酯酶简介 | 第13-18页 |
| ·酯酶结构 | 第13-14页 |
| ·酯酶的催化机制 | 第14-16页 |
| ·酯酶分类 | 第16-18页 |
| ·微生物酯酶来源及蹄选 | 第18-20页 |
| ·微生物脂肪酶 | 第18-19页 |
| ·产酯酶微生物筛选 | 第19-20页 |
| ·酯酶酶活检测 | 第20页 |
| ·平板法 | 第20页 |
| ·滴定法 | 第20页 |
| ·比色法 | 第20页 |
| ·酯酶应用 | 第20-24页 |
| ·去污剂工业 | 第21页 |
| ·医药工业 | 第21-22页 |
| ·食品工业 | 第22-24页 |
| ·冷活性酶 | 第24-31页 |
| ·冷活性酶来源 | 第25页 |
| ·冷活性酶生化特点 | 第25-26页 |
| ·冷活性酶分子结构特点 | 第26-27页 |
| ·冷活性酯酶的应用 | 第27-31页 |
| ·医学和医药中的应用 | 第28页 |
| ·精细化合物的合成 | 第28-30页 |
| ·食品工业中的应用 | 第30页 |
| ·家庭使用 | 第30-31页 |
| ·环境应用 | 第31页 |
| ·本研究目的和意义 | 第31-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-47页 |
| ·材料 | 第32-36页 |
| ·菌株与质粒 | 第32页 |
| ·试剂 | 第32-33页 |
| ·培养基 | 第33-34页 |
| ·溶液 | 第34-35页 |
| ·仪器设备 | 第35-36页 |
| ·产脂肪酶的深海细菌筛选与鉴定 | 第36-38页 |
| ·深海细菌的培养 | 第36页 |
| ·产脂肪酶深海细菌的筛选 | 第36页 |
| ·产脂肪酶细菌的16S rRNA分子鉴定 | 第36-38页 |
| ·产脂肪酶细菌基因组文库构建 | 第38-40页 |
| ·基因组总DNA抽提 | 第38页 |
| ·基因组总DNA预酶切及片段回收 | 第38-39页 |
| ·酶连 | 第39页 |
| ·大肠杆菌感受态制备 | 第39页 |
| ·电转化 | 第39-40页 |
| ·基因组文库质量的检测 | 第40页 |
| ·文库筛选和克隆子鉴定 | 第40-41页 |
| ·产脂肪酶克隆子筛选 | 第40页 |
| ·抽提重组克隆子质粒并测序 | 第40页 |
| ·生物信息学分析插入片段 | 第40页 |
| ·酯酶蛋白质氨基酸序列分析及进化树分析 | 第40-41页 |
| ·酯酶基因克隆 | 第41-43页 |
| ·酯酶基因的PCR扩增 | 第41-42页 |
| ·PCR片段回收、酶切及回收 | 第42页 |
| ·载体pGEX-6p-1的制备 | 第42页 |
| ·酶连 | 第42页 |
| ·重组质粒转化及验证 | 第42-43页 |
| ·酯酶基因表达和纯化 | 第43-44页 |
| ·酯酶基因诱导表达 | 第43页 |
| ·酯酶蛋白纯化 | 第43页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第43-44页 |
| ·酯酶酶学性质研究 | 第44-47页 |
| ·绘制对硝基苯酚标准曲线 | 第44页 |
| ·酯酶酶学性质检测方法 | 第44-45页 |
| ·酯酶最适反应温度测定 | 第45页 |
| ·酯酶最适反应pH测定 | 第45页 |
| ·酯酶温度稳定性测定 | 第45页 |
| ·酯酶pH稳定性测定 | 第45页 |
| ·金属离子和化合物对酯酶活性影响 | 第45-46页 |
| ·高浓度NaCl溶液对酯酶活性和稳定性的影响 | 第46页 |
| ·不同有机溶剂对酯酶稳定性影响 | 第46页 |
| ·不同去污剂对酯酶活性和稳定性的影响 | 第46页 |
| ·酯酶底物特异性 | 第46页 |
| ·酯酶酶动力学常数测定 | 第46-47页 |
| ·酯酶三级结构模拟和分析 | 第47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-72页 |
| ·产酯酶深海细菌筛选结果 | 第47页 |
| ·菌株分子鉴定 | 第47页 |
| ·基因组文库构建及筛选 | 第47-51页 |
| ·总DNA提取 | 第47-48页 |
| ·总DNA预酶切及酶切片段回收 | 第48-50页 |
| ·酶连产物转化大肠杆菌E. coli DH5α | 第50页 |
| ·文库筛选 | 第50-51页 |
| ·克隆子测序及分析 | 第51-56页 |
| ·酯酶基因est10分析 | 第51-52页 |
| ·酯酶基因est12分析 | 第52-53页 |
| ·酯酶蛋白进化树分析 | 第53-56页 |
| ·酯酶基因克隆 | 第56-57页 |
| ·酯酶蛋白诱导表达纯化 | 第57-58页 |
| ·酶学性质检测 | 第58-66页 |
| ·对硝基苯酚标准曲线 | 第58-59页 |
| ·温度对酯酶活性和稳定性的影响 | 第59页 |
| ·不同pH对酯酶活性和稳定性的影响 | 第59-62页 |
| ·金属离子和化合物对酯酶活性影响 | 第62-63页 |
| ·高浓度NaCl溶液对酯酶活性和稳定影响 | 第63-64页 |
| ·有机溶剂对酯酶稳定性影响 | 第64-66页 |
| ·去污剂对酯酶活性和稳定性影响 | 第66页 |
| ·酯酶底物特异性分析 | 第66-68页 |
| ·酯酶动力学常数 | 第68页 |
| ·酯酶蛋白三维结构模拟 | 第68-72页 |
| 4 讨论 | 第72-78页 |
| ·嗜冷杆菌Psychrobacter sp.特点 | 第72-73页 |
| ·冷活性分析 | 第73-74页 |
| ·耐盐性质 | 第74-76页 |
| ·有机溶剂耐受 | 第76页 |
| ·潜在的应用价值 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-89页 |
| 附录 | 第89-92页 |
| 发表论文 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
