| 目录 | 第1-14页 |
| 主要英文缩写 | 第14-16页 |
| 中文摘要 | 第16-21页 |
| 英文摘要 | 第21-26页 |
| 第一章 卵巢癌发病的生物学改变及分子机理(文献综述) | 第26-111页 |
| 1. 卵巢上皮的生物学特征 | 第26页 |
| 2. 卵巢癌的细胞遗传学 | 第26-29页 |
| ·染色体数目的改变 | 第27页 |
| ·染色体结构改变 | 第27-28页 |
| ·11号染色体与卵巢上皮癌 | 第28-29页 |
| 3 卵巢癌的分子遗传学 | 第29-57页 |
| ·癌基因 | 第30-45页 |
| ·ras 基因 | 第30-34页 |
| (1) ras 基因结构与功能 | 第30-31页 |
| (2) ras 基因活化机制 | 第31-32页 |
| (3) ras 基因与卵巢癌 | 第32-34页 |
| ·c-myc 基因 | 第34-36页 |
| (1) c-myc 癌基因结构 | 第34页 |
| (2) c-myc 基因的表达产物及功能 | 第34-35页 |
| (3) c-myc 癌基因与卵巢癌 | 第35-36页 |
| ·AKT2 基因 | 第36页 |
| ·erbB 基因 | 第36-44页 |
| (1) erbB 受体分类与结构 | 第36-37页 |
| (2) erbB 的信号传递机制 | 第37-38页 |
| (3) erbB 和卵巢肿瘤的关系 | 第38-44页 |
| ·PIK3CA | 第44-45页 |
| ·抑癌基因 | 第45-57页 |
| ·P53 基因 | 第45-49页 |
| (1) P53 基因结构及表达 | 第45-46页 |
| (2) P53 基因产物及功 | 第46-47页 |
| (3) P53 的失活机理 | 第47-48页 |
| (4) P53 突变与卵巢肿瘤 | 第48-49页 |
| ·P16 基因 | 第49-52页 |
| (1) P16 基因结构及表达 | 第49-50页 |
| (2) P16 基因的表达产物及功能 | 第50页 |
| (3) P16 基因与卵巢肿瘤 | 第50-52页 |
| ·BRCA1 和BRCA2 | 第52-53页 |
| ·4 PTEN 基因 | 第53-54页 |
| ·nm23 基因 | 第54-55页 |
| ·OPCML | 第55-57页 |
| (1) OPCML 基因的结构与生物学功能 | 第55-56页 |
| (2) OPCML 基因对卵巢癌关系 | 第56-57页 |
| 4 生长因子与卵巢癌 | 第57-69页 |
| ·生长因子的分类与作用途径 | 第57-58页 |
| ·表皮生长因子 | 第58-59页 |
| ·转化生长因子β | 第59-60页 |
| ·胰岛素样生长因子 | 第60-62页 |
| ·血管内皮生长因子 | 第62-64页 |
| ·血小板源性生长因子 | 第64-66页 |
| ·成纤维细胞生长因子 | 第66-69页 |
| 5 卵巢癌发生的动物模型 | 第69-76页 |
| ·自发性和非上皮性卵巢肿瘤动物模型 | 第69页 |
| ·体外转化卵巢上皮细胞的移植瘤 | 第69-70页 |
| ·人卵巢癌细胞异体移植瘤 | 第70-71页 |
| ·生殖内分泌因素导致的卵巢肿瘤 | 第71-73页 |
| (1) 排卵损伤诱发的卵巢癌 | 第71-72页 |
| (2) 高促性腺激素学说 | 第72-73页 |
| (3) 甾体类激素 | 第73页 |
| ·生殖细胞缺乏或耗尽诱导卵巢肿瘤 | 第73-74页 |
| ·环境因素致癌的动物模型 | 第74页 |
| ·转基因鼠巢癌动物模型 | 第74-76页 |
| (1) 转基因小鼠 | 第75页 |
| (2) 重组病毒携带目的基因直接囊内注射 | 第75-76页 |
| 6 综述参考文献 | 第76-111页 |
| 第二章 重组逆转录病毒介导的k-Ras/c-Myc 转基因小鼠卵巢癌动物模型的建立 | 第111-151页 |
| 前言 | 第111-112页 |
| 第一部分 CD1 小白鼠卵巢上皮细胞(MOSE)株的建立 | 第112-116页 |
| 1 材料与与方法 | 第112-114页 |
| ·动物来源 | 第112页 |
| ·主要试剂 | 第112页 |
| ·CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的分离 | 第112-113页 |
| ·CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的鉴定 | 第113-114页 |
| (1) 显微镜下细胞形态学特征 | 第113页 |
| (2) 细胞免疫组织化学染色检测CK19 | 第113-114页 |
| (3) 细胞免疫组织化学染色检测Vimentin | 第114页 |
| ·CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的培养与筛选 | 第114页 |
| 2 结果 | 第114页 |
| ·CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的形态学特征 | 第114页 |
| ·CD1小白鼠卵巢上皮细胞的CK-19及Vimentin免疫组化染色结果 | 第114页 |
| 3 小结 | 第114-116页 |
| 第二部分 pLPC-m Myc、pLHC-kRas 表达质粒的构建及鉴定 | 第116-128页 |
| 1 材料与方法 | 第116-124页 |
| ·质粒与菌株 | 第116页 |
| ·主要试剂与工具酶 | 第116-117页 |
| ·主要仪器 | 第117页 |
| ·质粒构建 | 第117-124页 |
| ·pLPC-m Myc 质粒构建 | 第117-121页 |
| ·构建步骤 | 第117-120页 |
| ·pLPC-mMyc 质粒DNA 的制备 | 第120-121页 |
| ·pLPC-m My质粒鉴定与序列测定 | 第121页 |
| ·pLHC-kRas的构建 | 第121-124页 |
| 2 结果 | 第124-127页 |
| ·pLPC-mMyc 表达质粒的构建及鉴定结果 | 第124-125页 |
| (1) 酶切结果 | 第124页 |
| (2) 测序结果 | 第124-125页 |
| ·pLHC-kRas 表达质粒的构建及鉴定 | 第125-127页 |
| (1) 酶切结果 | 第125页 |
| (2) 测序结果 | 第125-127页 |
| 3 小结 | 第127-128页 |
| 第三部分 重组逆转录病毒介导的c-Myc 和k-Ras 基因在CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的表达及其生物学行为改变 | 第128-141页 |
| 1 材料 | 第128页 |
| ·包装细胞来源 | 第128页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第128页 |
| ·主要仪器 | 第128页 |
| 2 方法 | 第128-135页 |
| ·重组逆转录病毒的制备 | 第128-129页 |
| ·筛选药物浓度的测定 | 第129页 |
| ·携带c-Myc 和k-Ras 基因重组逆转录病毒感染CD1 小白鼠卵巢上皮细胞 | 第129-130页 |
| ·表达c-Myc 的细胞系(Myc)的建立 | 第129-130页 |
| ·表达k-Ras 的细胞系(Ras)的建立 | 第130页 |
| ·表达k-Ras 和c-Myc 细胞系(RM)的建立 | 第130页 |
| ·CD1 小白鼠卵巢上皮细胞c-Myc 和k-Ras 基因mRNA 转录的检测 | 第130-132页 |
| ·细胞总 RNA 的抽提 | 第130页 |
| ·逆转录 | 第130-131页 |
| ·PCR | 第131-132页 |
| ·转基因CD1 小白鼠卵巢上皮细胞mMyc、k-Ras 及TsAg 基因蛋白表达检测(Western blot) | 第132-133页 |
| ·细胞增殖试验 | 第133页 |
| ·软琼脂中克隆形成试验 | 第133-134页 |
| ·细胞体外侵袭能力测定 | 第134-135页 |
| ·统计学处理 | 第135页 |
| 3 结果 | 第135-139页 |
| ·目的基因及其表达的检测 | 第135-136页 |
| (1) RT-PCR 检测目的基因表达结果 | 第135页 |
| (2) Western blot 检测目的基因蛋白质的表达结果 | 第135-136页 |
| (3) TsAg 检测结果 | 第136页 |
| ·转基因后细胞增殖能力的变化 | 第136-137页 |
| ·克隆形成 | 第137-139页 |
| ·细胞侵袭能力的变化 | 第139页 |
| 4 小结 | 第139-141页 |
| 第四部分 重组逆转录病毒介导的转基因小鼠卵巢癌动物模型的建立 | 第141-145页 |
| 1 材料与方法 | 第141页 |
| ·动物来源及实验分组 | 第141页 |
| ·细胞培养 | 第141页 |
| ·体内成瘤试验 | 第141页 |
| ·荷瘤鼠肿瘤组织病理学检查及c-Myc 和k-Ras 基因蛋白表达测定 | 第141页 |
| ·统计学处理 | 第141页 |
| 2 结果 | 第141-144页 |
| ·各转基因组细胞在裸鼠体内成瘤比较 | 第141-142页 |
| ·荷瘤鼠肿瘤组织病理形态学及腹水细胞学情况 | 第142-143页 |
| ·荷瘤鼠肿瘤组织c-Myc 和k-Ras 基因蛋白表达情况 | 第143-144页 |
| 3 小结 | 第144-145页 |
| 第五部分 讨论 | 第145-151页 |
| 1 卵巢癌动物模型建立的意义 | 第145页 |
| 2 k-Ras 和c-Myc 诱导卵巢癌发的机理 | 第145-147页 |
| 3 本研究所建逆转录病毒介导的转基因小鼠卵巢癌动物模型的特点及价值 | 第147-150页 |
| 4 小结 | 第150-151页 |
| 第三章 抑癌基因 OPCML 的克隆及其在卵巢癌中功能的研究 | 第151-195页 |
| 前言 | 第151页 |
| 第一部分 OPCML基因的克隆及表达质粒构建 | 第151-169页 |
| 1 材料 | 第151-152页 |
| ·组织来源 | 第151页 |
| ·细胞来源及培养 | 第151页 |
| ·质粒与菌种 | 第151页 |
| ·主要试剂及工具酶 | 第151-152页 |
| ·主要仪器 | 第152页 |
| 2 方法 | 第152-157页 |
| ·从小鼠正常组织中克隆 OPCML 基因 | 第152-156页 |
| ·克隆引物的设计 | 第152页 |
| ·OPCML 基因的克隆 | 第152-153页 |
| (1) 组织总RNA 的提取 | 第152-153页 |
| (2) RT-PCR | 第153页 |
| (3) PCR | 第153页 |
| (4) 扩增目的基因片段的回收 | 第153页 |
| ·OPCML 基因表达质粒pcDNA3-OPCML 的构建 | 第153-156页 |
| (1) PCR 产物的磷酸化(插入片段) | 第153-154页 |
| (2) 载体的准备 | 第154页 |
| (3) 将 OPCML 导入表达载体pcDNA3 | 第154-156页 |
| ·pcDNA3-OPCML 的测序 | 第156页 |
| ·pcDNA3-OPCML质粒DNA的制备 | 第156页 |
| ·OPCML 基因表达的检测 | 第156-157页 |
| (1) pcDNA3-OPCML 转染293T 细胞 | 第156页 |
| (2) Western blot 检测 OPCML 蛋白表达 | 第156-157页 |
| 3 结果 | 第157-168页 |
| (1) OPCML 测序结果 | 第157-167页 |
| (2) 新构建的pcDNA3-OPCML 质粒结构图 | 第167页 |
| (3) Western blot 检测OPCML 蛋白结果 | 第167-168页 |
| 4 小结 | 第168-169页 |
| 第二部分 OPCML 重组慢病毒转基因系统的构建 | 第169-175页 |
| 1 材料 | 第169-170页 |
| ·细胞来源及培养 | 第169页 |
| ·质粒与菌种 | 第169页 |
| ·主要试剂、试剂盒及工具酶 | 第169页 |
| ·主要仪器 | 第169-170页 |
| 2 方法 | 第170-172页 |
| ·技术路线 | 第170页 |
| ·pWPI-GFP 和pcDNA3-OPCML 质粒DNA 提取 | 第170页 |
| (1) pcDNA3-OPCML 质粒 DNA 提取 | 第170页 |
| (2) pWPI-GFP 质粒 DNA 提取 | 第170页 |
| ·插入载体的制备 | 第170-171页 |
| ·插入片段(OPCML)的制备 | 第171-172页 |
| ·OPCML 与pWPI-GFP 的连结与转化 | 第172页 |
| ·pWPI-OPCML 质粒的扩增、筛选与鉴定 | 第172页 |
| ·pWPI-OPCML 质粒表达 GFP 的检测 | 第172页 |
| ·pWPI-OPCML 质粒表达 OPCML 蛋白的检测 | 第172页 |
| 3 结果 | 第172-174页 |
| (1) PCR 筛选pWPI-OPCML 阳性克隆结果 | 第172-173页 |
| (2) 酶切鉴定正向插入和反向插入结果 | 第173页 |
| (3) 新建慢病毒表达质粒pWPI-OPCML 结构图 | 第173-174页 |
| (4) pWPI-OPCML 质粒GFP 和 OPCML 蛋白表达测定结果 | 第174页 |
| 4 小结 | 第174-175页 |
| 第三部分 OPCML 基因对卵巢上皮癌生物学行为影响的体内外实验研究 | 第175-191页 |
| 1 材料 | 第175-176页 |
| ·卵巢上皮癌细胞系来源、培养及实验分组 | 第175页 |
| ·动物来源、饲养及实验分组 | 第175页 |
| ·质粒 | 第175页 |
| ·主要试剂、试剂盒期 | 第175-176页 |
| ·主要仪器 | 第176页 |
| 2 方法 | 第176-180页 |
| ·携带OPCML 基因的重组慢病毒的制备 | 第176页 |
| ·重组病毒介导 OPCML 基因导入靶细胞 | 第176-177页 |
| ·卵巢上皮癌细胞系 OPCML 基因表达检测 | 第177-178页 |
| ·基因转导效率的检测 | 第177页 |
| (1) 标记荧光蛋白GFP 的检测 | 第177页 |
| (2) FCM 检测 GFP 阳性细胞百分数 | 第177页 |
| ·目的基因蛋白质 OPCML 表达的 Western blot 检测 | 第177-178页 |
| ·OPCML 对卵巢上皮癌生物行为影响的体外实验 | 第178-179页 |
| ·细胞增殖试验 | 第178页 |
| ·细胞聚合力试验 | 第178页 |
| ·细胞周期测定 | 第178-179页 |
| ·OPCML 基因对卵巢上皮癌生物行为影响的体内实验 | 第179-180页 |
| ·体内移植瘤形成试验 | 第179页 |
| ·荧光显微镜检测移植瘤中 GFP 的表达 | 第179页 |
| ·免疫组织化学检测移植瘤中 OPCML 蛋白质的表达 | 第179-180页 |
| ·统计学处理 | 第180页 |
| 3 结果 | 第180-190页 |
| ·包装细胞293T 中 GFP 检测结果 | 第180-181页 |
| ·基因转导效率的检测结果 | 第181-183页 |
| ·Western blot 检测目的基因蛋白 OPCML 卵巢癌细胞系中表达结果 | 第183页 |
| ·OPCML 对细胞增殖能力的影响 | 第183-185页 |
| ·OPCML 对细胞周期的影响 | 第185-187页 |
| ·OPCML 对细胞聚合力影响 | 第187页 |
| ·OPCML 对体内移植瘤生长抑制的影响 | 第187-189页 |
| ·荧光显微镜检测移植瘤中 GFP 的表达结果 | 第189页 |
| ·荷瘤鼠肿瘤组织病理学检查及免疫组化检测OPCML 蛋白表达结果 | 第189-190页 |
| 4 小结 | 第190-191页 |
| 第四部分 讨论 | 第191-195页 |
| 1 OPCML 基因的生物学功能及与恶性肿瘤的关系 | 第191-192页 |
| 2 OPCML 基因对卵巢上皮癌生物行为的影响 | 第192-193页 |
| 3 慢病毒载体系统介导的基因转导的价值与意义 | 第193-195页 |
| 小结 | 第195-196页 |
| 论文参考文献 | 第196-206页 |
