| 前言 | 第1-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-37页 |
| ·紫杉醇及其药源问题的研究 | 第12-16页 |
| ·紫杉醇生物合成的上游途径及其相关基因克隆 | 第16-28页 |
| ·萜类在细胞质中通过MVA途径生物合成 | 第18页 |
| ·萜类在质体中通过DXP途径生物合成 | 第18-19页 |
| ·MVA途径上的基因和酶 | 第19-23页 |
| ·乙酰CoA:乙酰CoA酰基转运酶 (AACT) | 第20-21页 |
| ·3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶 (HMGS) | 第21页 |
| ·3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR) | 第21-22页 |
| ·MVA途径上的2个激酶:甲瓦龙酸激酶(MK)和磷酸甲瓦龙酸激酶(PMK) | 第22页 |
| ·甲瓦龙酸5-焦磷酸脱羧酶(MDC) | 第22页 |
| ·异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI) | 第22-23页 |
| ·DXP途径上的基因和酶 | 第23-27页 |
| ·1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS) | 第24-25页 |
| ·1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR) | 第25-26页 |
| ·2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT) | 第26页 |
| ·4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK) | 第26页 |
| ·2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MECPS) | 第26-27页 |
| ·羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶(HDS) | 第27页 |
| ·DXP途径上最后的一个酶:异戊烯基焦磷酸/二甲基烯丙基焦磷酸合成酶(IDS) | 第27页 |
| ·MVA途径和DXP途径之间的交流(Crosstalk) | 第27-28页 |
| ·紫杉醇生物合成下游途径的鉴定及其相关酶基因克隆 | 第28-36页 |
| ·紫杉醇20碳前体骨架GGPP的生物合成 | 第28-29页 |
| ·紫杉二烯合成酶催化GGPP环化生成紫杉二烯 | 第29-30页 |
| ·紫杉二烯官能化过程中涉及到的酶和基因 | 第30-36页 |
| ·紫杉醇生物合成的羟化酶 | 第31-34页 |
| ·紫杉醇生物合成的酰化酶 | 第34-36页 |
| ·我们的工作定位 | 第36-37页 |
| 第二章 材料与方法 | 第37-82页 |
| ·植物材料 | 第37页 |
| ·菌株和表达载体 | 第37页 |
| ·仪器和设备 | 第37-38页 |
| ·试剂 | 第38-41页 |
| ·试剂盒及购买的试剂 | 第38-39页 |
| ·自配的主要标准试剂 | 第39-41页 |
| ·自配的其它试剂 | 第41页 |
| ·方法与步骤 | 第41-82页 |
| ·曼地亚红豆杉材料的准备 | 第41页 |
| ·东北红豆杉细胞的诱导处理 | 第41页 |
| ·诱导处理东北红豆杉细胞RNA的抽提 | 第41-42页 |
| ·从成熟的曼地亚红豆杉组织中提取高质量RNA | 第42-43页 |
| ·曼地亚红豆杉DNA的提取 | 第43-44页 |
| ·曼地亚红豆杉基因组步移DNA库的构建 | 第44页 |
| ·从曼地亚红豆杉总RNA合成第一链cDNA | 第44-46页 |
| ·方案一:使用Invitrogen公司的3’RACE试剂盒进行反转 | 第44-45页 |
| ·方案二 使用Clontech公司的反转录试剂盒进行反转 | 第45-46页 |
| ·紫杉醇生物合成上游途径中重要酶基因克隆 | 第46-62页 |
| ·tmhmgr、tmfps、tmipi、tmdxs、tmdxr基因核心片段的获得 | 第46-48页 |
| ·tmggpps基因的基因组核心片段的获得 | 第48页 |
| ·曼地亚红豆杉RACE-Ready cDNA的合成 | 第48-49页 |
| ·tmhmgr的的克隆 | 第49-53页 |
| ·tmfps、tmipi、tmdxs、tmdxr的克隆 | 第53-57页 |
| ·tmggpps的克隆 | 第57-62页 |
| ·Southern blot分析 | 第62-68页 |
| ·试剂配制 | 第62-64页 |
| ·探针的制备 | 第64页 |
| ·探针的标记 | 第64-65页 |
| ·曼地亚红豆杉基因组DNA的限制性酶切消化 | 第65-66页 |
| ·Southern凝胶电泳 | 第66页 |
| ·Southern凝胶转膜和固定 | 第66-67页 |
| ·探针与尼龙膜的Southern杂交和检测 | 第67页 |
| ·封阻、抗体温育和洗膜 | 第67-68页 |
| ·自显影 | 第68页 |
| ·基因表达分析 | 第68-70页 |
| ·Northern blot分析 | 第68-69页 |
| ·RT-PCR分析 | 第69-70页 |
| ·克隆、测序 | 第70-73页 |
| ·凝胶电泳 | 第70页 |
| ·凝胶电泳条带或酶切产物的柱层析回收 | 第70-71页 |
| ·大肠杆菌DH5α和XL1-Blue感受态的制备 | 第71页 |
| ·DNA回收片段与pGEM-T Easy Vector载体的连接 | 第71页 |
| ·DNA与pGEM-T Easy Vector的连接产物转化DH5α感受态 | 第71-72页 |
| ·转化重组载体后的DH5α单菌落培养和质粒的提取 | 第72-73页 |
| ·引物合成、转化重组子的鉴定、测序 | 第73页 |
| ·生物信息学分析 | 第73页 |
| ·基因的功能验证 | 第73-82页 |
| ·tmhmgr基因在HMGR缺陷型酵母突变体JRY2394中的功能验证 | 第73-76页 |
| ·tmfps基因的在FPS缺陷型酵母突变体中的功能验证 | 第76-77页 |
| ·tmggpps基因在酵母突变体SFNY368中的功能验证 | 第77-79页 |
| ·tmipi基因的功能验证 | 第79-82页 |
| 第三章 紫杉醇生物合成上游途径中重要酶基因克隆 | 第82-132页 |
| ·建立从成熟红豆杉组织中提取高质量RNA的方法 | 第82-84页 |
| ·曼地亚红豆杉中MVA途径上重要酶基因的克隆、分析与功能鉴定 | 第84-100页 |
| ·3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(TmHMGR)基因克隆、分析与功能鉴定 | 第84-92页 |
| ·tmhmgr全长cDNA的分子克隆 | 第85-86页 |
| ·TmHMGR的生物信息学分析 | 第86-90页 |
| ·tmhmgr在酵母中的功能互补 | 第90页 |
| ·Southern和 Northern杂交分析 | 第90-91页 |
| ·tmhmgr研究小结 | 第91-92页 |
| ·异戊烯基焦磷酸异构酶(TmIPI)基因克隆、分析与功能鉴定 | 第92-100页 |
| ·tmipi全长cDNA的分子克隆 | 第92-93页 |
| ·TmIPI的生物信息学分析 | 第93-98页 |
| ·tmipi的功能验证 | 第98-99页 |
| ·Southern杂交分析 | 第99-100页 |
| ·tmipi研究小结 | 第100页 |
| ·蔓地亚红豆杉中DXP途径上重要酶基因的克隆与分析 | 第100-117页 |
| ·1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(TmDXS)基因的克隆与分析 | 第101-110页 |
| ·tmdxs全长cDNA的分子克隆 | 第101-103页 |
| ·TmDXS的生物信息学分析 | 第103-108页 |
| ·tmdxs的Southern和表达分析 | 第108-109页 |
| ·tmdxs研究的小结 | 第109-110页 |
| ·1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(TmDXR)基因的克隆与分析 | 第110-117页 |
| ·tmdxr全长cDNA的分子克隆 | 第110-111页 |
| ·TmDXR的生物信息学分析 | 第111-116页 |
| ·tmdxr研究小结 | 第116-117页 |
| ·蔓地亚红豆杉中IPP缩合形成GGPP途径上基因的克隆、分析和功能鉴定 | 第117-132页 |
| ·法尼基焦磷酸合成酶(TmFPS) 基因的克隆、分析和功能鉴定 | 第117-125页 |
| ·tmfps全长cDNA的分子克隆 | 第118-119页 |
| ·TmFPS的生物信息学分析 | 第119-123页 |
| ·tmfps在酵母中的功能互补 | 第123-124页 |
| ·Southern和 Northern杂交分析 | 第124-125页 |
| ·tmfps基因研究小结 | 第125页 |
| ·香叶基香叶基焦磷酸合成酶(TmGGPPS) 基因的克隆、分析和功能鉴定 | 第125-132页 |
| ·tmggpps基因组序列和全长cDNA的分子克隆 | 第126-127页 |
| ·TmGGPPS的生物信息学分析 | 第127-129页 |
| ·tmggpps在酵母中的功能互补验证 | 第129-130页 |
| ·MeJA处理东北红豆杉细胞后tmggpps的表达 | 第130-131页 |
| ·tmggpps研究小结 | 第131-132页 |
| 第四章 结论与展望 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-149页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第149-150页 |
| 附录1 引物 | 第150-153页 |
| 附录2 GenBank Accession numbers | 第153-154页 |
| 附录3 缩略词表 | 第154-157页 |
| 致谢 | 第157页 |
