| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-9页 |
| 第1章 前言 | 第13-29页 |
| 1.1 基因编辑技术 | 第13-15页 |
| 1.2 CRISPR/Cas | 第15-18页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9介导的基因编辑研究进展 | 第18-20页 |
| 1.4 真核生物sgRNA表达系统 | 第20-22页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9介导的条件性基因编辑 | 第22-25页 |
| 1.6 本论文工作研究意义与思路 | 第25-28页 |
| 1.7 课题创新点 | 第28-29页 |
| 第2章 RNA聚合酶Ⅱ直接转录sgRNA的功能研究 | 第29-51页 |
| 2.1 材料 | 第29-30页 |
| 2.1.1 实验主要溶液配制 | 第29-30页 |
| 2.1.2 试剂 | 第30页 |
| 2.1.3 仪器 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-41页 |
| 2.2.1 载体构建 | 第30-32页 |
| 2.2.2 分子克隆 | 第32-35页 |
| 2.2.3 细胞培养 | 第35页 |
| 2.2.4 PEI转染试剂介导质粒DNA转染293T细胞 | 第35-36页 |
| 2.2.5 双荧光素酶报告基因分析检测CRISPR/Cas9系统的活性 | 第36-37页 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因分析 | 第37-38页 |
| 2.2.7 I-SceI核酸酶切分析检测基因编辑效率 | 第38页 |
| 2.2.8 RNA的提取和定量PCR | 第38-41页 |
| 2.2.9 统计分析 | 第41页 |
| 2.3 实验结果 | 第41-48页 |
| 2.3.1 RNA聚合酶Ⅱ启动子直接表达的sgRNA载体设计和构建 | 第41-43页 |
| 2.3.2 构建检测基因编辑效率的荧光素酶报告载体 | 第43-47页 |
| 2.3.3 检测CMV启动子表达的sgRNA的编辑效率 | 第47-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-51页 |
| 第3章 MiRNA和RISCbasedsgRNA的设计和验证 | 第51-82页 |
| 3.1 材料 | 第51-52页 |
| 3.1.1 实验主要溶液配制 | 第51-52页 |
| 3.1.2 试剂 | 第52页 |
| 3.1.3 仪器 | 第52页 |
| 3.2 实验方法 | 第52-63页 |
| 3.2.1 细胞培养 | 第52页 |
| 3.2.2 PEI转染试剂介导质粒DNA转染HEK293T细胞 | 第52页 |
| 3.2.3 分子克隆 | 第52-53页 |
| 3.2.4 载体构建 | 第53-58页 |
| 3.2.5 双荧光素酶报告基因分析CRISPR/Cas9系统的编辑效率 | 第58-59页 |
| 3.2.6 I-SceI核酸酶切分析检测基因编辑效率 | 第59页 |
| 3.2.7 双荧光素酶报告基因检测miRNA或shRNAsensor | 第59页 |
| 3.2.8 RNA提取和定量PCR | 第59-61页 |
| 3.2.9 Northernblots | 第61-63页 |
| 3.2.10 统计分析 | 第63页 |
| 3.3 结果 | 第63-75页 |
| 3.3.1 MiRNA-basedsgRNA和RISC-basedsgRNA载体设计 | 第63-67页 |
| 3.3.2 RNA聚合酶Ⅱ表达miRNA和RISCbasedsgRNA的功能验证 | 第67-71页 |
| 3.3.3 研究sgRNA的插入位置对miRNAbasedsgRNA编辑效率的影响 | 第71-73页 |
| 3.3.4 研究sgRNA插入位置对miRNA表达水平及活性的影响 | 第73-75页 |
| 3.4 讨论 | 第75-82页 |
| 第4章 MiRNAbasedsgRNA的应用 | 第82-102页 |
| 4.1 材料 | 第82页 |
| 4.1.1 实验主要溶液配制 | 第82页 |
| 4.1.2 试剂 | 第82页 |
| 4.1.3 仪器 | 第82页 |
| 4.2 方法 | 第82-89页 |
| 4.2.1 载体构建 | 第82-85页 |
| 4.2.2 分子克隆 | 第85页 |
| 4.2.3 细胞培养 | 第85-86页 |
| 4.2.4 PEI转染试剂介导质粒DNA转染293T细胞 | 第86页 |
| 4.2.5 Lipo3000转染试剂介导质粒DNA转染N2a和HEK293T细胞 | 第86-87页 |
| 4.2.6 双荧光素酶报告基因分析CRISPR/Cas9系统的活性 | 第87-88页 |
| 4.2.7 I-SceI核酸酶切分析检测基因编辑效率 | 第88页 |
| 4.2.8 PfIMI核酸酶切分析检测基因编辑效率 | 第88页 |
| 4.2.9 统计分析 | 第88-89页 |
| 4.3 结果 | 第89-95页 |
| 4.3.1 MiRNAbasedsgRNA可以进行神经特异性基因编辑 | 第89-90页 |
| 4.3.2 MiRNAbasedsgRNA可以进行多基因编辑 | 第90-92页 |
| 4.3.3 MiRNAbasedsgRNA可以用于改善同源重组编辑效率 | 第92-95页 |
| 4.4 讨论 | 第95-102页 |
| 第5章 结论与展望 | 第102-106页 |
| 5.1 结论 | 第102-103页 |
| 5.2 展望 | 第103-106页 |
| 参考文献 | 第106-112页 |
| 致谢 | 第112-114页 |
| 附录 | 第114-116页 |
| 论文中涉及的缩略词 | 第114-116页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第116页 |
