| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-17页 |
| 1.1 海参 | 第10页 |
| 1.2 海参自溶与内源蛋白酶 | 第10-11页 |
| 1.3 丝氨酸蛋白酶（SEP）概述 | 第11-12页 |
| 1.3.1 SEP的结构 | 第11页 |
| 1.3.2 SEP的研究进展 | 第11-12页 |
| 1.4 丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）概述 | 第12-15页 |
| 1.4.1 SPI分类 | 第12-13页 |
| 1.4.2 SPI的结构及抑制机理 | 第13-14页 |
| 1.4.3 SPI的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.4.4 SPI和SEP的相互作用关系 | 第15页 |
| 1.5 研究意义和内容 | 第15-17页 |
| 第二章 SPI基因的克隆、原核表达及其在自溶中的变化规律 | 第17-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-21页 |
| 2.1.1 实验原料 | 第17页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第17-18页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.4 实验试剂配方 | 第19-21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-37页 |
| 2.2.1 刺参Total RNA的提取 | 第21页 |
| 2.2.2 刺参SPI基因的获取 | 第21-27页 |
| 2.2.2.1 引物设计与合成 | 第21-22页 |
| 2.2.2.2 cDNA的合成及SPI的特异性序列获取 | 第22-23页 |
| 2.2.2.3 3’-RACE扩增 | 第23-25页 |
| 2.2.2.4 目的基因ORF验证及测序 | 第25-27页 |
| 2.2.3 刺参SPI基因全长序列的生物信息学分析 | 第27-28页 |
| 2.2.3.1 等电点和分子量的预测 | 第27页 |
| 2.2.3.2 信号肽预测 | 第27页 |
| 2.2.3.3 氨基酸疏水性预测 | 第27页 |
| 2.2.3.4 蛋白质跨膜区预测 | 第27页 |
| 2.2.3.5 蛋白质结构域及活性位点预测 | 第27-28页 |
| 2.2.3.6 蛋白质二级结构预测 | 第28页 |
| 2.2.3.7 SPI氨基酸序列的同源性比对 | 第28页 |
| 2.2.4 刺参SPI、SEP基因表达模式分析 | 第28-31页 |
| 2.2.4.1 刺参不同部位的样品采集及自溶实验 | 第28页 |
| 2.2.4.2 刺参Total RNA的提取及纯化 | 第28-29页 |
| 2.2.4.3 RNA的纯度及反转录 | 第29页 |
| 2.2.4.4 引物设计与合成 | 第29页 |
| 2.2.4.5 荧光Real-Time PCR | 第29-30页 |
| 2.2.4.6 建立标准曲线 | 第30-31页 |
| 2.2.4.7 样品检测及数据处理 | 第31页 |
| 2.2.5 刺参SPI的蛋白重组表达 | 第31-37页 |
| 2.2.5.1 引物设计与合成 | 第31页 |
| 2.2.5.2 SPI基因ORF区的扩增及纯化 | 第31-33页 |
| 2.2.5.3 重组表达质粒pET-21b-SPI的构建 | 第33页 |
| 2.2.5.4 重组质粒的转化及测序 | 第33-34页 |
| 2.2.5.5 重组菌的制备 | 第34-35页 |
| 2.2.5.6 重组菌的培养及诱导 | 第35-36页 |
| 2.2.5.7 重组蛋白SPI-His的复性及纯化 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第37-60页 |
| 3.1 总RNA提取 | 第37页 |
| 3.2 刺参SPI基因序列的克隆 | 第37-39页 |
| 3.2.1 SPI同源序列的扩增 | 第37-38页 |
| 3.2.2 3’-RACE PCR扩增 | 第38-39页 |
| 3.2.3 ORF验证 | 第39页 |
| 3.3 刺参SPI全长序列的生物信息学分析 | 第39-45页 |
| 3.3.1 分子量和等电点的预测 | 第40页 |
| 3.3.2 信号肽预测 | 第40-41页 |
| 3.3.3 氨基酸疏水性分析 | 第41-42页 |
| 3.3.4 蛋白质跨膜区域预测 | 第42页 |
| 3.3.5 SPI蛋白质结构域及活性位点预测 | 第42页 |
| 3.3.6 SPI蛋白质二级结构分析 | 第42-43页 |
| 3.3.7 氨基酸序列的同源性比对 | 第43-45页 |
| 3.4 刺参SPI和SEP基因表达模式分析 | 第45-56页 |
| 3.4.1 RNA提取结果 | 第45页 |
| 3.4.2 实时荧光定量PCR检测方法的建立 | 第45-49页 |
| 3.4.2.1 Cytb基因标准曲线的建立 | 第45-47页 |
| 3.4.2.2 SPI基因标准曲线的建立 | 第47-48页 |
| 3.4.2.3 SEP基因标准曲线的建立 | 第48-49页 |
| 3.4.3 实时荧光定量PCR结果 | 第49-56页 |
| 3.4.3.1 SPI和SEP的组织分布 | 第49-51页 |
| 3.4.3.2 时序表达定量结果 | 第51-56页 |
| 3.5 刺参SPI蛋白重组表达 | 第56-60页 |
| 3.5.1 SPI基因ORF区扩增 | 第56-57页 |
| 3.5.2 重组质粒的构建及鉴定 | 第57-58页 |
| 3.5.3 重组菌的培养及诱导表达 | 第58-60页 |
| 第四章 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
