| 致谢 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 中英文缩写对照表 | 第17-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-45页 |
| 1.1 脂肪酶概述 | 第18-25页 |
| 1.1.1 脂肪酶概述 | 第18页 |
| 1.1.2 脂肪酶结构特点 | 第18-22页 |
| 1.1.3 脂肪酶的催化机理 | 第22-23页 |
| 1.1.4 脂肪酶位置专一性 | 第23-24页 |
| 1.1.5 sn-1,3专一性脂肪酶应用 | 第24-25页 |
| 1.2 脂肪酶资源挖掘和性能改良 | 第25-37页 |
| 1.2.1 产脂肪酶微生物筛选 | 第26-29页 |
| 1.2.2 脂肪酶生产菌株遗传改良 | 第29-30页 |
| 1.2.3 脂肪酶的重组表达和优化 | 第30-31页 |
| 1.2.4 脂肪酶的蛋白质工程 | 第31-35页 |
| 1.2.5 脂肪酶制剂化及催化改良 | 第35-37页 |
| 1.3 脂肪酶的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达 | 第37-42页 |
| 1.3.1 P.pastoris表达系统 | 第37-38页 |
| 1.3.2 毕赤酵母重组表达优化方法 | 第38-42页 |
| 1.4 共表达系统 | 第42-43页 |
| 1.5 课题意义、研究内容 | 第43-45页 |
| 第二章 产sn-1,3专一性脂肪酶微生物筛选和发酵 | 第45-69页 |
| 2.1 引言 | 第45页 |
| 2.2 材料与方法 | 第45-51页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 2.2.2 样品的采集与初筛 | 第47-48页 |
| 2.2.3 细菌摇瓶复筛 | 第48页 |
| 2.2.4 脂肪酶酶活测定 | 第48-49页 |
| 2.2.5 产酶细菌菌株生长特性及生理生化鉴定 | 第49页 |
| 2.2.6 细菌脂肪酸谱分析 | 第49页 |
| 2.2.7 真菌的菌种鉴定 | 第49页 |
| 2.2.8 真菌发酵培养 | 第49-50页 |
| 2.2.9 诱导发酵单因素分析 | 第50页 |
| 2.2.10 Plackett-Burman设计筛选影响脂肪酶产量的显著因素 | 第50页 |
| 2.2.11 最陡爬坡实验和响应面设计 | 第50-51页 |
| 2.2.12 脂肪酶位置专一性鉴定 | 第51页 |
| 2.3 结果与分析 | 第51-67页 |
| 2.3.1 pNPP法测定脂肪酶酶活 | 第51-52页 |
| 2.3.2 产脂肪酶菌株的筛选和分离 | 第52页 |
| 2.3.3 产脂肪酶细菌菌株的形态、生理和产酶特征鉴定 | 第52-53页 |
| 2.3.4 基于脂肪酸谱的产酶细菌菌种鉴定 | 第53-55页 |
| 2.3.5 产脂肪酶细菌菌株系统发育分析 | 第55页 |
| 2.3.6 脂肪酶生物信息学分析 | 第55-56页 |
| 2.3.7 产脂肪酶真菌微生物筛选和菌种鉴定 | 第56-57页 |
| 2.3.8 发酵表达单因素优化实验 | 第57-60页 |
| 2.3.9 发酵产脂肪酶的显著因素筛选 | 第60-62页 |
| 2.3.10 最陡爬坡实验确定响应面实验因素的中心点水平 | 第62页 |
| 2.3.11 响应面中心组合设计确定显著因素的最优水平 | 第62-66页 |
| 2.3.12 脂肪酶专一性鉴定 | 第66-67页 |
| 2.4 讨论与小结 | 第67-69页 |
| 2.4.1 讨论 | 第67-68页 |
| 2.4.2 小结 | 第68-69页 |
| 第三章 sn-1,3专一性脂肪酶在酵母中的重组表达 | 第69-91页 |
| 3.1 引言 | 第69页 |
| 3.2 材料与方法 | 第69-75页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第69-71页 |
| 3.2.2 大肠杆菌感受态细胞制备和热激法转化 | 第71-72页 |
| 3.2.3 基因合成及表达载体构建 | 第72页 |
| 3.2.4 P.Pastoris感受态细胞制备、转化和筛选 | 第72-73页 |
| 3.2.5 重组菌株的诱导表达和脂肪酶酶活测定 | 第73页 |
| 3.2.6 pH和温度对TLP和TLA的影响 | 第73-74页 |
| 3.2.7 有机溶剂、表面活性剂和金属离子对TLP和TLA的影响 | 第74页 |
| 3.2.8 TLP和TLA位置专一性鉴定 | 第74页 |
| 3.2.9 SDS-PAGE电泳和Western blot分析 | 第74-75页 |
| 3.3 结果与分析 | 第75-89页 |
| 3.3.1 coTLL和coRML基因的设计与合成 | 第75-77页 |
| 3.3.2 TLL基因表达载体构建和酵母转化筛选 | 第77-79页 |
| 3.3.3 重组TLL的诱导表达和鉴定 | 第79-81页 |
| 3.3.4 温度和pH对TLP和TLA的影响 | 第81-82页 |
| 3.3.5 有机溶剂、表面活性剂和金属离子对TLP和TLA的影响 | 第82-85页 |
| 3.3.6 TLP和TLA位置专一性鉴定 | 第85页 |
| 3.3.7 RML脂肪酶基因克隆、表达载体构建 | 第85-86页 |
| 3.3.8 RML脂肪酶诱导表达 | 第86-88页 |
| 3.3.9 RML温度稳定性、最适温度鉴定 | 第88-89页 |
| 3.4 讨论与小结 | 第89-91页 |
| 3.4.1 讨论 | 第89-90页 |
| 3.4.2 小结 | 第90-91页 |
| 第四章 sn-1,3专一性脂肪酶的分子改造 | 第91-111页 |
| 4.1 引言 | 第91页 |
| 4.2 材料与方法 | 第91-96页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第91-92页 |
| 4.2.2 基因克隆和表达载体构建 | 第92-93页 |
| 4.2.3 表达载体定点突变 | 第93-95页 |
| 4.2.4 表达载体的P.pastoris转化和筛选 | 第95页 |
| 4.2.5 重组菌株的诱导表达和脂肪酶酶活测定 | 第95页 |
| 4.2.6 脂肪酶温度稳定性鉴定 | 第95页 |
| 4.2.7 SDS-PAGE电泳 | 第95页 |
| 4.2.8 分子动力学模拟 | 第95-96页 |
| 4.3 结果与分析 | 第96-106页 |
| 4.3.1 载体构建和酵母转化 | 第96-98页 |
| 4.3.2 前导肽-脂肪酶的酵母重组表达 | 第98-100页 |
| 4.3.3 脂肪酶热稳定性鉴定 | 第100-101页 |
| 4.3.4 前导肽变体对脂肪酶表达的影响 | 第101-104页 |
| 4.3.5 RML Kex2酶切位点改造 | 第104-106页 |
| 4.4 总结与讨论 | 第106-111页 |
| 4.4.1 讨论 | 第106-109页 |
| 4.4.2 小结 | 第109-111页 |
| 第五章 sn-1,3专一性脂肪酶同工酶共表达 | 第111-123页 |
| 5.1 引言 | 第111-112页 |
| 5.2 材料与方法 | 第112-115页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第112-113页 |
| 5.2.2 同工酶共表达载体构建 | 第113-115页 |
| 5.2.3 P.pastoris转化和筛选 | 第115页 |
| 5.2.4 重组菌株的诱导表达和脂肪酶酶活测定 | 第115页 |
| 5.2.5 SDS-PAGE电泳 | 第115页 |
| 5.2.6 蛋白质同源建模 | 第115页 |
| 5.3 结果与分析 | 第115-122页 |
| 5.3.1 表达载体构建 | 第115-116页 |
| 5.3.2 Kex2介导的同工酶共表达 | 第116-118页 |
| 5.3.3 融合表达的同工酶共表达 | 第118-120页 |
| 5.3.4 2A多肽介导的同工酶共表达 | 第120-122页 |
| 5.4 总结与讨论 | 第122-123页 |
| 第六章 脂肪酶重组菌的高密度发酵及脂肪酶应用 | 第123-140页 |
| 6.1 引言 | 第123页 |
| 6.2 材料与方法 | 第123-130页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第123-125页 |
| 6.2.2 摇瓶水平诱导条件优化 | 第125页 |
| 6.2.3 pNPP法脂肪酶酶活测定 | 第125-126页 |
| 6.2.4 SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第126页 |
| 6.2.5 发酵罐高密度发酵 | 第126-128页 |
| 6.2.6 脂肪酶固定化 | 第128-129页 |
| 6.2.7 功能性油脂OPO合成 | 第129-130页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第130-139页 |
| 6.3.1 毕赤酵母产脂肪酶摇瓶水平诱导表达 | 第130-131页 |
| 6.3.2 生长阶段接种量与甘油浓度优化 | 第131-132页 |
| 6.3.3 甲醇浓度对产酶的影响 | 第132-133页 |
| 6.3.4 pH对产酶的影响 | 第133-134页 |
| 6.3.5 辅助碳源对产酶的影响 | 第134-135页 |
| 6.3.6 表面活性剂对产酶的影响 | 第135-136页 |
| 6.3.7 重组TLL毕赤酵母高密度发酵 | 第136-138页 |
| 6.3.8 TLL脂肪酶的固定化和OPO合成 | 第138-139页 |
| 6.4 总结与讨论 | 第139-140页 |
| 第七章 总结和展望 | 第140-145页 |
| 7.1 全文总结 | 第140-142页 |
| 7.2 论文创新点 | 第142-143页 |
| 7.3 工作展望 | 第143-145页 |
| 参考文献 | 第145-157页 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 | 第157页 |
