| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 普鲁兰酶概述 | 第13-18页 |
| 1.1.1 普鲁兰酶的底物特异性 | 第13-14页 |
| 1.1.2 普鲁兰酶的分类 | 第14页 |
| 1.1.3 普鲁兰酶的来源及性质 | 第14-15页 |
| 1.1.4 普鲁兰酶的制备 | 第15-16页 |
| 1.1.5 普鲁兰酶的应用 | 第16-18页 |
| 1.2 大肠杆菌表达系统 | 第18-20页 |
| 1.2.1 促进大肠杆菌表达可溶性蛋白的策略 | 第18-19页 |
| 1.2.2 强化大肠杆菌胞外分泌蛋白的策略 | 第19-20页 |
| 1.3 芽孢杆菌表达系统 | 第20-21页 |
| 1.3.1 芽孢杆菌表达普鲁兰酶概述 | 第20页 |
| 1.3.2 短小芽孢杆菌表达系统简介 | 第20-21页 |
| 1.4 立题依据与研究意义 | 第21页 |
| 1.5 主要研究内容 | 第21-23页 |
| 第二章 表面活性剂促进普鲁兰酶在大肠杆菌中的可溶性分泌表达研究 | 第23-33页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 材料和方法 | 第23-26页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第23-24页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第24页 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 | 第24-25页 |
| 2.2.4 菌体生物量的测定 | 第25页 |
| 2.2.5 超声波法破碎细胞 | 第25页 |
| 2.2.6 普鲁兰酶活力测定 | 第25-26页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第26-31页 |
| 2.3.1 表面活性剂对普鲁兰酶活性聚集体的解聚作用 | 第26-27页 |
| 2.3.2 表面活性剂种类对大肠杆菌生长和产酶的影响 | 第27-28页 |
| 2.3.3 Triton X-100 浓度对大肠杆菌生长和产酶的影响 | 第28-29页 |
| 2.3.4 Triton X-100 添加时间对大肠杆菌生长和产酶的影响 | 第29-30页 |
| 2.3.5 Triton X-100 对大肠杆菌 3-L罐高密度发酵的影响 | 第30-31页 |
| 2.4 小结 | 第31-33页 |
| 第三章 优化诱导方式结合甘氨酸流加策略促进普鲁兰酶在大肠杆菌中胞外表达研究 | 第33-44页 |
| 3.1 引言 | 第33页 |
| 3.2 材料与方法 | 第33-35页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第33页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第33-34页 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 | 第34页 |
| 3.2.4 菌体生物量的测定 | 第34页 |
| 3.2.5 超声波法破碎细胞 | 第34页 |
| 3.2.6 普鲁兰酶活力测定 | 第34页 |
| 3.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳分析 | 第34页 |
| 3.2.8 甘氨酸浓度的测定 | 第34-35页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第35-42页 |
| 3.3.1 诱导剂种类和浓度对大肠杆菌生长和产酶的影响 | 第35-36页 |
| 3.3.2 甘氨酸浓度对大肠杆菌生长和产酶的影响 | 第36-37页 |
| 3.3.3 乳糖流加速度对大肠杆菌 3-L罐高密度发酵产普鲁兰酶的影响 | 第37-38页 |
| 3.3.4 诱导时间对大肠杆菌 3-L罐高密度发酵产普鲁兰酶的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.5 甘氨酸流加策略对大肠杆菌 3-L罐高密度发酵产普鲁兰酶的影响 | 第39-41页 |
| 3.3.6 普鲁兰酶在大肠杆菌中表达的“混态构象”模型 | 第41-42页 |
| 3.4 小结 | 第42-44页 |
| 第四章 普鲁兰酶在短小芽孢杆菌中的表达、摇瓶优化以及酶学性质研究 | 第44-66页 |
| 4.1 引言 | 第44页 |
| 4.2 材料与方法 | 第44-50页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第44页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第44-45页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第45页 |
| 4.2.4 菌体生物量的测定 | 第45-46页 |
| 4.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳分析 | 第46页 |
| 4.2.6 普鲁兰酶活力测定 | 第46页 |
| 4.2.7 葡萄糖浓度的测定 | 第46页 |
| 4.2.8 分子生物学操作 | 第46-50页 |
| 4.2.9 普鲁兰酶的纯化及天然分子量的测定 | 第50页 |
| 4.2.10 重组普鲁兰酶的酶学性质分析 | 第50页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第50-64页 |
| 4.3.1 重组短小芽孢杆菌Brevibacillus choshinensis (p NCMO2/pul A-d2)的构建 | 第50-52页 |
| 4.3.2 重组短小芽孢杆菌的摇瓶优化 | 第52-61页 |
| 4.3.3 重组普鲁兰酶的酶学性质研究 | 第61-64页 |
| 4.4 小结 | 第64-66页 |
| 第五章 镁离子促进重组短小芽孢杆菌表达“高活性”普鲁兰酶的机制研究 | 第66-80页 |
| 5.1 引言 | 第66页 |
| 5.2 材料和方法 | 第66-69页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第66页 |
| 5.2.2 试剂和仪器 | 第66页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第66-67页 |
| 5.2.4 菌体生物量的测定 | 第67页 |
| 5.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳分析 | 第67页 |
| 5.2.6 重组普鲁兰酶的纯化 | 第67页 |
| 5.2.7 普鲁兰酶活力的测定 | 第67页 |
| 5.2.8 a-CGT酶活力的测定 | 第67页 |
| 5.2.9 蔗糖异构酶活力的测定 | 第67页 |
| 5.2.10 麦芽淀粉酶活力的测定 | 第67页 |
| 5.2.11 细胞透射电镜(Transmission electron microscopy, TEM)分析 | 第67-68页 |
| 5.2.12 SYBR Green I荧光定量PCR | 第68-69页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第69-79页 |
| 5.3.1 镁离子促进重组短小芽孢杆菌表达“高活性”普鲁兰酶 | 第69-70页 |
| 5.3.2 镁离子对短小芽孢杆菌表达其他异源蛋白的影响 | 第70-71页 |
| 5.3.3 镁离子对短小芽孢杆菌表达的普鲁兰酶纯酶比活及聚集状态的影响 | 第71-72页 |
| 5.3.4 热处理区别普鲁兰酶的活性和非活性形式 | 第72-73页 |
| 5.3.5 镁离子对短小芽孢杆菌表达的普鲁兰酶二级结构的影响 | 第73-74页 |
| 5.3.6 镁离子对短小芽孢杆菌细胞形态的影响 | 第74-75页 |
| 5.3.7 镁离子对pul A-d2和HWP基因转录和对应蛋白表达水平的影响 | 第75-77页 |
| 5.3.8 普鲁兰酶在短小芽孢杆菌中表达的“折叠主控型”机制 | 第77-79页 |
| 5.4 小结 | 第79-80页 |
| 第六章 重组短小芽孢杆菌生产普鲁兰酶的 3-L罐发酵优化研究 | 第80-89页 |
| 6.1 前言 | 第80页 |
| 6.2 材料与方法 | 第80-81页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第80页 |
| 6.2.2 试剂和仪器 | 第80页 |
| 6.2.3 培养基和培养条件 | 第80页 |
| 6.2.4 菌体生物量的测定 | 第80-81页 |
| 6.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳分析 | 第81页 |
| 6.2.6 普鲁兰酶活力测定 | 第81页 |
| 6.2.7 葡萄糖浓度的测定 | 第81页 |
| 6.2.8 质粒稳定性分析 | 第81页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第81-87页 |
| 6.3.1 重组短小芽孢杆菌 3-L罐分批发酵 | 第81-82页 |
| 6.3.2 p H对重组短小芽孢杆菌发酵的影响 | 第82-83页 |
| 6.3.3 溶氧对重组短小芽孢杆菌发酵的影响 | 第83-84页 |
| 6.3.4 无机氮源对重组短小芽孢杆菌发酵的影响 | 第84-85页 |
| 6.3.5 牛肉浸膏浓度对重组短小芽孢杆菌发酵的影响 | 第85-86页 |
| 6.3.6 普鲁兰酶在不同宿主菌中表达的比较 | 第86-87页 |
| 6.4 小结 | 第87-89页 |
| 第七章 重组普鲁兰酶在 6-a-麦芽糖基-b-环糊精制备中的应用 | 第89-96页 |
| 7.1 引言 | 第89页 |
| 7.2 材料和方法 | 第89-90页 |
| 7.2.1 试剂和仪器 | 第89页 |
| 7.2.2 Mal-b-CD的转化及检测 | 第89-90页 |
| 7.3 结果与讨论 | 第90-95页 |
| 7.3.1 重组普鲁兰酶与商品酶在Mal-b-CD制备中的比较 | 第90-91页 |
| 7.3.2 温度对Mal-b-CD合成的影响 | 第91页 |
| 7.3.3 p H对Mal-b-CD合成的影响 | 第91-92页 |
| 7.3.4 有机溶剂对Mal-b-CD合成的影响 | 第92-93页 |
| 7.3.5 乙醇浓度对Mal-b-CD合成的影响 | 第93页 |
| 7.3.6 底物浓度对Mal-b-CD合成的影响 | 第93-94页 |
| 7.3.7 麦芽糖与b-CD摩尔比对Mal-b-CD合成的影响 | 第94页 |
| 7.3.8 加酶量对Mal-b-CD合成的影响 | 第94页 |
| 7.3.9 反应时间对Mal-b-CD合成的影响 | 第94-95页 |
| 7.4 小结 | 第95-96页 |
| 主要结论与展望 | 第96-99页 |
| 论文主要创新点 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-107页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第107页 |
