| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略词表 | 第9-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-22页 |
| 1 猪流行性腹泻概述 | 第15-18页 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒的分子生物学进展 | 第15-16页 |
| 1.2 PEDV细胞适应性研究 | 第16-17页 |
| 1.3 PEDV细胞受体研究进展 | 第17-18页 |
| 2 猪氨肽酶研究进展 | 第18-21页 |
| 2.1 猪氨肽酶结构、功能、表达分布 | 第18-19页 |
| 2.2 表达pAPN细胞系的研究 | 第19-20页 |
| 2.3 pAPN与病毒作用结构域的研究进展 | 第20-21页 |
| 3 本研究的目的与意义 | 第21-22页 |
| 第二部分 研究内容 | 第22-60页 |
| 1 材料 | 第22-23页 |
| 1.1 菌株、毒株 | 第22页 |
| 1.2 主要试剂 | 第22页 |
| 1.3 主要仪器 | 第22-23页 |
| 2 方法 | 第23-34页 |
| 2.1 猪氨肽酶(pAPN)基因的克隆 | 第23-28页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第23页 |
| 2.1.2 pAPN基因的扩增 | 第23-25页 |
| 2.1.3 pAPN基因的克隆 | 第25-26页 |
| 2.1.4 克隆重组质粒的鉴定 | 第26-27页 |
| 2.1.5 pAPN基因编码蛋白的生物信息学分析 | 第27-28页 |
| 2.2 稳定表达猪氨肽酶的HEK-293细胞系的构建与鉴定 | 第28-32页 |
| 2.2.1 真核表达质粒pcDNA3.1-pAPN的构建与鉴定 | 第28页 |
| 2.2.2 真核表达质粒的转染与表达 | 第28-30页 |
| 2.2.3 细胞系鉴定与稳定性分析 | 第30-32页 |
| 2.3 PEDV感染稳定表达猪氨肽酶HEK293-pAPN细胞系的验证 | 第32-34页 |
| 2.3.1 PEDV SC-L株的复苏 | 第32页 |
| 2.3.2 PEDV感染表达猪氨肽酶的HEK-293细胞系的验证 | 第32-33页 |
| 2.3.3 荧光定量PCR方法绘制PEDV增殖曲线 | 第33-34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-54页 |
| 3.1 仔猪氨肽酶(pAPN)基因的克隆和分析 | 第34-42页 |
| 3.1.1 pAPN基因的克隆 | 第34页 |
| 3.1.2 pAPN基因序列测定 | 第34-38页 |
| 3.1.3 pAPN基因编码氨基酸分析 | 第38页 |
| 3.1.4 pAPN基因核苷酸序列进化树分析 | 第38-40页 |
| 3.1.5 pAPN蛋白信号肽分析 | 第40页 |
| 3.1.6 pAPN蛋白的跨膜区分析 | 第40-41页 |
| 3.1.7 pAPN蛋白结构预测 | 第41页 |
| 3.1.8 真核表达质粒pcDNA3.1-pAPN的构建 | 第41-42页 |
| 3.2 表达猪APN的HEK293-pAPN细胞系的建立和鉴定 | 第42-47页 |
| 3.2.1 HEK293-pAPN细胞系初步鉴定 | 第42-44页 |
| 3.2.2 HEK293-pAPN细胞系稳定性鉴定 | 第44-47页 |
| 3.3 PEDV感染HEK293-pAPN细胞系的验证实验 | 第47-52页 |
| 3.3.1 Vero细胞培养PEDV | 第47-49页 |
| 3.3.2 PEDV感染HEK293-pAPN细胞的病变 | 第49-50页 |
| 3.3.3 HEK293-pAPN细胞培养PEDV | 第50-52页 |
| 3.4 PEDV在HEK293-pAPN细胞和Vero细胞增殖趋势比较 | 第52-54页 |
| 4 讨论 | 第54-59页 |
| 4.1 氨肽酶基因的选择 | 第54-55页 |
| 4.2 真核表达质粒的选择 | 第55-56页 |
| 4.3 目的基因的体外表达 | 第56页 |
| 4.4 新建细胞系表达氨肽酶的稳定性分析 | 第56-57页 |
| 4.5 新建HEK293-pAPN细胞系应用 | 第57-59页 |
| 5 结论 | 第59页 |
| 6 研究创新点 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 附录 | 第68-70页 |
| 1 主要试剂的配置 | 第68-69页 |
| 2 质粒：pcDNA3.1/myc-His(-)A | 第69-70页 |
| 3 攻读学位期间发表的学术论文 | 第70页 |
