| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 目录 | 第6-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-17页 |
| ·蛋白水解酶 | 第9页 |
| ·脯氨酰内肽酶 | 第9-11页 |
| ·PEP 的特性 | 第9-10页 |
| ·分布 | 第10页 |
| ·PEP 的作用机制 | 第10页 |
| ·PEP 的生理作用 | 第10-11页 |
| ·脯氨酰内肽酶及其抑制剂的应用 | 第11-12页 |
| ·大豆多肽概述 | 第12-13页 |
| ·大豆多肽的价值 | 第12页 |
| ·大豆多肽产品存在的问题 | 第12-13页 |
| ·酿酒酵母表面展示系统 | 第13-15页 |
| ·酿酒酵母表面展示系统的类型 | 第13-14页 |
| ·酿酒酵母表面展现技术的应用 | 第14-15页 |
| ·本论文的立题意义和研究内容 | 第15-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-27页 |
| ·实验材料 | 第17-19页 |
| ·菌株和质粒 | 第17页 |
| ·酶和主要试剂 | 第17页 |
| ·寡核苷酸引物 | 第17-18页 |
| ·主要培养基 | 第18页 |
| ·实验仪器和设备 | 第18-19页 |
| ·实验方法 | 第19-27页 |
| ·烟曲霉总 RNA 的提取及反转录合成 cDNA | 第19-20页 |
| ·酿酒酵母染色体 DNA 的提取 | 第20页 |
| ·目的基因的 PCR 扩增 | 第20页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第20-21页 |
| ·质粒的提取 | 第21页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的电击转化 | 第21页 |
| ·酿酒酵母醋酸锂转化法 | 第21页 |
| ·重组酵母的发酵试验 | 第21-22页 |
| ·酶活力测定方法 | 第22页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第22-24页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第24页 |
| ·酶学性质分析 | 第24页 |
| ·大豆蛋白的酶解反应 | 第24-25页 |
| ·水解度 DH 值的测定 | 第25-26页 |
| ·苦味评价方法 | 第26页 |
| ·大豆分离蛋白水解液中的多肽分布测定 | 第26页 |
| ·游离氨基酸含量测定 | 第26页 |
| ·重组酿酒酵母菌的遗传稳定性分析 | 第26-27页 |
| 第三章 实验结果 | 第27-54页 |
| ·烟曲霉脯氨酰内肽酶基因的克隆与鉴定 | 第27-29页 |
| ·烟曲霉 cDNA 的获取 | 第27页 |
| ·目的基因的 PCR 扩增及序列测定 | 第27-28页 |
| ·重组表达载体 pPIC9K-PEP 的构建 | 第28-29页 |
| ·重组毕赤酵母的分泌表达 | 第29-31页 |
| ·重组酵母的表型鉴定及 G418 抗性筛选 | 第29-30页 |
| ·重组菌的诱导曲线及其分析 | 第30-31页 |
| ·重组菌 25 L 发酵罐实验 | 第31页 |
| ·重组酶的分离纯化 | 第31-34页 |
| ·硫酸铵分级沉淀条件的确定 | 第31-32页 |
| ·Phenyl FF 疏水层析 | 第32-33页 |
| ·Sephadex G200 凝胶过滤层析 | 第33页 |
| ·重组脯氨酰内肽酶的纯化结果分析 | 第33-34页 |
| ·重组酶的酶学性质分析 | 第34-38页 |
| ·最适温度及温度稳定性 | 第34-35页 |
| ·最适 pH 及 pH 稳定性 | 第35-36页 |
| ·金属离子及 EDTA 对重组酶活性的影响 | 第36页 |
| ·Km 值的测定 | 第36-37页 |
| ·等电聚焦 | 第37页 |
| ·重组 PEP 对二肽、三肽及大分子干酪素水解能力比较分析 | 第37-38页 |
| ·PEP 对大豆多肽的水解性能研究 | 第38-48页 |
| ·PEP 的制备 | 第38页 |
| ·大豆蛋白酶解条件的确定 | 第38-39页 |
| ·中性蛋白酶和 PEP 依次水解大豆分离蛋白 | 第39-42页 |
| ·中性蛋白酶和 PEP 协同水解大豆分离蛋白 | 第42-44页 |
| ·碱性蛋白酶和 PEP 依次水解大豆分离蛋白 | 第44-47页 |
| ·PEP 水解大豆分离蛋白多肽的风味变化 | 第47-48页 |
| ·酿酒酵母锚定表达 PEP | 第48-54页 |
| ·目的基因的 PCR 扩增 | 第48-49页 |
| ·酿酒酵母表面展示载体 pMGK-PEP-AG 的构建 | 第49-51页 |
| ·重组酿酒酵母的 PCR 鉴定 | 第51页 |
| ·重组酿酒酵母的酶活检测 | 第51-52页 |
| ·酿酒酵母工程菌的稳定性试验 | 第52页 |
| ·重组酿酒酵母菌表面展示的 PEP 对大豆多肽的苦味影响 | 第52-54页 |
| 第四章 讨论 | 第54-57页 |
| 结论与展望 | 第57-59页 |
| 主要结论 | 第57-58页 |
| 展望 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第64页 |
