| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 1 绪论 | 第12-19页 |
| ·γ-癸内酯的简介 | 第12-13页 |
| ·GDL生产技术的研究进展 | 第13页 |
| ·Yarrowia lipolytica酵母发酵生产GDL的代谢途径 | 第13-14页 |
| ·Yarrowia lipolytica发酵生产GDL基因水平的研究 | 第14-16页 |
| ·Yarrowia lipolytica发酵生产GDL过程中的影响因素 | 第16-18页 |
| ·本论文的研究意义和内容 | 第18-19页 |
| 2 敲除Yarrowia lipolitica酵母细胞中POX3基因发酵生产GDL | 第19-51页 |
| ·前言 | 第19页 |
| ·实验材料 | 第19-22页 |
| ·实验菌株和质粒 | 第19-20页 |
| ·实验引物设计 | 第20页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第20页 |
| ·主要实验仪器 | 第20-21页 |
| ·主要生化试剂 | 第21页 |
| ·培养基和溶液的配制 | 第21-22页 |
| ·实验方法 | 第22-36页 |
| ·实验技术路线 | 第22-23页 |
| ·菌种活化 | 第23页 |
| ·液体种子培养 | 第23页 |
| ·Yarrowia lipolytica野生型和缺陷型酵母基因组的提取 | 第23-24页 |
| ·PCR扩增标记基因Ura3 | 第24页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第24-25页 |
| ·Ura3基因片段的回收 | 第25页 |
| ·标记基因Ura3的回补 | 第25-26页 |
| ·POX3敲除组件基因片段的PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·提取pSP72原质粒 | 第27页 |
| ·POX3-L和质粒pSP72双酶切 | 第27-28页 |
| ·POX3-L和pSP72酶连 | 第28-29页 |
| ·大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第29页 |
| ·重组质粒pSP72-PL的转化 | 第29页 |
| ·提取重组质粒pSP72-PL进行酶切验证 | 第29-30页 |
| ·标记基因Ura3和pSP72-PL的连接 | 第30-31页 |
| ·POX3-R和pSP72-PLU的连接 | 第31-32页 |
| ·POX3-Re和pSP72-PLUR的连接 | 第32-33页 |
| ·验证重组质粒pSP72-PLUReR | 第33页 |
| ·电击转化POX3敲除组件 | 第33-34页 |
| ·转化酵母重组菌株的筛选和鉴定 | 第34页 |
| ·敲除组件的二次重组 | 第34页 |
| ·二次重组酵母的筛选和鉴定 | 第34-35页 |
| ·γ-癸内酯及内标标曲的建立 | 第35页 |
| ·重组菌株发酵检测GDL | 第35-36页 |
| ·实验结果与分析 | 第36-50页 |
| ·酵母基因组的提取 | 第36页 |
| ·标记基因Ura3的获得 | 第36-37页 |
| ·标记基因Ura3的回补 | 第37页 |
| ·敲除组件基因片段的PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·提取pSP72原始质粒 | 第38页 |
| ·POX3-L和质粒pSP72的连接 | 第38-39页 |
| ·标记基因Ura3和pSP72-PL的连接 | 第39-40页 |
| ·POX3-R和pSP72-PLU的连接 | 第40页 |
| ·POX3-Re和pSP72-PLUR的连接 | 第40-41页 |
| ·验证重组质粒pSP72-PLUReR | 第41-42页 |
| ·电击转化POX3敲除组件 | 第42-43页 |
| ·转化酵母重组菌株的筛选和鉴定 | 第43-44页 |
| ·诱导敲除组件的二次重组 | 第44页 |
| ·二次重组酵母菌株的筛选和鉴定 | 第44-46页 |
| ·γ-癸内酯及内标标曲的建立 | 第46-48页 |
| ·重组菌株发酵检测GDL | 第48-50页 |
| ·本章小结 | 第50-51页 |
| 3 敲除Yarrowia lipolytica酵母细胞中GUT2基因发酵生产GDL | 第51-70页 |
| ·引言 | 第51页 |
| ·实验材料 | 第51-52页 |
| ·实验菌株和质粒 | 第51-52页 |
| ·实验引物设计 | 第52页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第52页 |
| ·实验仪器 | 第52页 |
| ·主要生化试剂 | 第52页 |
| ·培养基和溶液的配制 | 第52页 |
| ·实验方法 | 第52-60页 |
| ·实验技术路线 | 第52-53页 |
| ·敲除组件基因片段的PCR扩增 | 第53-54页 |
| ·GUT2-L和质粒pSP72的连接 | 第54-56页 |
| ·标记基因Ura3和pSP72-GL的连接 | 第56-57页 |
| ·GUT2-R和pSP72-GLU的连接 | 第57-58页 |
| ·GUT2-Re和pSP72-GLUR的连接 | 第58-59页 |
| ·验证重组质粒pSP72-GLUReR | 第59页 |
| ·电击转化GUT2敲除组件 | 第59-60页 |
| ·转化酵母重组菌株的筛选和鉴定 | 第60页 |
| ·诱导敲除组件的二次重组 | 第60页 |
| ·二次重组酵母的筛选和鉴定 | 第60页 |
| ·重组菌株发酵检测GDL | 第60页 |
| ·实验结果与分析 | 第60-69页 |
| ·敲除组件基因片段的PCR扩增 | 第60-61页 |
| ·GUT2-L和质粒pSP72的连接 | 第61页 |
| ·标记基因Ura3和pSP72-GL的连接 | 第61-62页 |
| ·GUT2-R和pSP72-GLU的连接 | 第62-63页 |
| ·GUT2-Re和pSP72-GLUR的连接 | 第63页 |
| ·验证重组质粒pSP72-GLUReR | 第63-64页 |
| ·电击转化GUT2敲除组件 | 第64-65页 |
| ·转化酵母重组菌株的筛选和鉴定 | 第65-66页 |
| ·诱导敲除组件的二次重组、筛选及鉴定 | 第66-68页 |
| ·重组菌株发酵检测GDL | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 4 同时敲除Yarrowia lipolitica酵母细胞中POX3和GUT2基因 | 第70-75页 |
| ·前言 | 第70页 |
| ·实验材料 | 第70-71页 |
| ·实验菌株 | 第70页 |
| ·实验引物设计 | 第70页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第70-71页 |
| ·实验仪器 | 第71页 |
| ·主要试剂 | 第71页 |
| ·培养基和溶液的配制 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71-72页 |
| ·电击转化GUT2敲除组件 | 第71页 |
| ·转化酵母重组菌株的筛选和鉴定 | 第71页 |
| ·诱导敲除组件的二次重组 | 第71页 |
| ·二次重组酵母的筛选和鉴定 | 第71页 |
| ·重组菌株发酵检测GDL | 第71-72页 |
| ·实验结果与讨论 | 第72-74页 |
| ·电击转化GUT2敲除组件 | 第72页 |
| ·转化酵母重组菌株的筛选和鉴定 | 第72-73页 |
| ·诱导敲除组件的二次重组、筛选及鉴定 | 第73-74页 |
| ·本章小结 | 第74-75页 |
| 结论 | 第75-76页 |
| 后续工作展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-81页 |
| 附录A PCR扩增POX3-DLU及Blast比对结果 | 第81-84页 |
| 附录B PCR扩增POX3-URD及Blast比对结果 | 第84-87页 |
| 附录C PCR扩增POX3-AR及Blast比对结果 | 第87-89页 |
| 附录D PCR扩增GUT2-DLU及Blast比对结果 | 第89-91页 |
| 附录E PCR扩增GUT2-URD及Blast比对结果 | 第91-94页 |
| 附录F PCR扩增GUT2-AR及Blast比对结果 | 第94-96页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第96-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
