| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-19页 |
| 1 斐济病毒属 | 第11-14页 |
| ·种类、传播介体、症状与分布 | 第11-12页 |
| ·斐济病毒粒子 | 第12-13页 |
| ·斐济病毒粒子的形态 | 第12页 |
| ·斐济病毒粒子的特征 | 第12-13页 |
| ·病毒粒子在寄主组织中的分布 | 第13页 |
| ·结构蛋白 | 第13页 |
| ·几种斐济病毒的基因组结构 | 第13-14页 |
| 2 斐济病毒属(Fijivirus)成员系统进化关系 | 第14-17页 |
| 3 基因组研究与病毒检测 | 第17页 |
| 4 水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)与玉米粗缩病毒(MRDV)的相互关系 | 第17-18页 |
| 5 本课题研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 RBSDV基因组片段S5的cDNA克隆和全序列分析 | 第19-31页 |
| 1 材料 | 第19-20页 |
| ·试剂 | 第19-20页 |
| ·仪器 | 第20页 |
| ·病样 | 第20页 |
| ·菌株和质粒 | 第20页 |
| 2 方法 | 第20-25页 |
| ·RNA抽提 | 第20-21页 |
| ·病毒基因组提纯 | 第21-22页 |
| ·基因组片段S5的扩增 | 第22-23页 |
| ·PCR产物的切胶纯化 | 第23-24页 |
| ·T-A连接 | 第24页 |
| ·感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第24页 |
| ·转化和筛选 | 第24页 |
| ·质粒的少量提纯 | 第24-25页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第25页 |
| ·核酸序列测定及分析 | 第25页 |
| 3 结果 | 第25-30页 |
| ·RBSDV基因组片段S5的扩增 | 第25-26页 |
| ·扩增产物的克隆和序列分析 | 第26-30页 |
| 4 讨论 | 第30-31页 |
| 第三章 水稻黑条矮缩病毒S5的原核表达、抗血清的制备及其特性研究 | 第31-46页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| ·病样 | 第31页 |
| ·菌株、载体与引物 | 第31-32页 |
| 2 方法 | 第32-36页 |
| ·RBSDV粒子提纯 | 第32页 |
| ·病株蛋白的提取 | 第32页 |
| ·PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·PCR产物的切胶纯化 | 第33页 |
| ·PCR产物与pGEM-T载体的连接 | 第33页 |
| ·感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第33页 |
| ·转化 | 第33页 |
| ·DNA序列测定 | 第33页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第33-34页 |
| ·酶切与回收目的片段的基因和表达载体片段 | 第33页 |
| ·目的基因片段与表达载体的连接 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第34页 |
| ·IPTG诱导表达 | 第34页 |
| ·SDS-PAGE检测目的基因的表达 | 第34页 |
| ·抗血清制备 | 第34-35页 |
| ·目的蛋白纯化 | 第34-35页 |
| ·免疫小鼠(ICR)制备抗血清 | 第35页 |
| ·Western blot检测抗血清纯度 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE | 第35页 |
| ·Western blot | 第35-36页 |
| ·抗血清的效价测定 | 第36页 |
| ·ELISA检测 | 第36页 |
| 3 结果和分析 | 第36-44页 |
| ·S5的原核表达载体的构建 | 第36-39页 |
| ·原核表达载体pET-p5A-1的构建 | 第36-37页 |
| ·原核表达载体pSBET-p5A-2的构建 | 第37页 |
| ·原核表达载体pSBET-p5A-3的构建 | 第37-39页 |
| ·S5B的原核表达载体pET-p5B的构建 | 第39页 |
| ·S5编码蛋白的原核表达及优化 | 第39-42页 |
| ·p5A-1、p5A-2、p5A-3蛋白表达的诱导及优化 | 第39-41页 |
| ·p5B蛋白表达的诱导及优化 | 第41-42页 |
| ·Western blot检测 | 第42-44页 |
| ·p5A-1、p5A-2和p5A-3的Western blot检测 | 第42-43页 |
| ·p5B的Western blot检测 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-46页 |
| 第四章 RBSDV S5BC基因对水稻的遗传转化及其检测 | 第46-61页 |
| 1 材料 | 第46-49页 |
| ·受体水稻品种 | 第46页 |
| ·农杆菌菌株及质粒 | 第46页 |
| ·酶和化学试剂 | 第46-47页 |
| ·引物 | 第47页 |
| ·培养基的配制 | 第47-48页 |
| ·各种激素、抗生素的配制 | 第48-49页 |
| 2 方法 | 第49-54页 |
| ·植物表达载体pRR-S5B的构建 | 第49页 |
| ·植物表达载体pRR-S5B的农杆菌转化 | 第49页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第49页 |
| ·植物表达载体导入农杆菌感受态细胞 | 第49页 |
| ·重组转化子的PCR鉴定 | 第49页 |
| ·农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第49-50页 |
| ·转化受体的准备 | 第49-50页 |
| ·水稻成熟胚愈伤组织的诱导及继代培养 | 第50页 |
| ·愈伤组织与农杆菌的共培养 | 第50页 |
| ·抗性愈伤组织的筛选 | 第50页 |
| ·植株的再生 | 第50页 |
| ·水稻总DNA的大量提取 | 第50-51页 |
| ·水稻总DNA的小量提取 | 第51页 |
| ·Southern blot分析 | 第51-53页 |
| ·植物基因组DNA的酶切 | 第52页 |
| ·电泳及转膜 | 第52页 |
| ·探针标记 | 第52-53页 |
| ·Southern杂交与严格的洗膜 | 第53页 |
| ·杂交信号的检测 | 第53页 |
| ·RT-PCR检测 | 第53-54页 |
| ·用RNeasy Plant mini(QIAGEN)试剂盒提取RBSDV总RNA | 第53-54页 |
| ·反转录合成cDNA第一链 | 第54页 |
| ·Western blot分析 | 第54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-60页 |
| ·植物表达载体pRR-S5B的构建 | 第54-55页 |
| ·pRR-S5B载体转化农杆菌及PCR验证 | 第55-56页 |
| ·水稻的转化 | 第56-58页 |
| ·愈伤组织的诱导和培养 | 第56页 |
| ·抗性愈伤组织的筛选 | 第56页 |
| ·抗性愈伤组织的植株再生 | 第56-58页 |
| ·T0代转基因水稻的检测 | 第58页 |
| ·PCR检测 | 第58页 |
| ·Southern杂交检测 | 第58页 |
| ·T1代转基因水稻的检测 | 第58-60页 |
| ·RT-PCR | 第58-59页 |
| ·Western杂交检测 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-61页 |
| 第五章 主要结论与进一步研究的建议 | 第61-62页 |
| 1 主要结论 | 第61页 |
| 2 进一步研究建议 | 第61-62页 |
| 附录 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 作者简介 | 第69页 |
