| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-8页 |
| 中英文缩写词表 | 第8-13页 |
| 一、绪论 | 第13-30页 |
| 1、前言 | 第13页 |
| 2、综述 | 第13-28页 |
| ·硒元素简介 | 第13-14页 |
| ·硒元素的代谢 | 第14-15页 |
| ·硒和硒蛋白的生物学功能 | 第15-22页 |
| ·抗氧化功能 | 第15-16页 |
| ·机体免疫 | 第16-18页 |
| ·甲状腺激素代谢 | 第18-19页 |
| ·动物繁殖 | 第19-20页 |
| ·对人与动物健康的影响 | 第20-22页 |
| ·硒蛋白的合成机理 | 第22-24页 |
| ·原核生物硒蛋白的合成 | 第23页 |
| ·真核生物硒蛋白的合成 | 第23-24页 |
| ·TrxR2和SelH研究进展 | 第24-26页 |
| ·大肠杆菌表达系统的简介 | 第26-27页 |
| ·抗体制备原理 | 第27-28页 |
| 3、立题依据 | 第28-29页 |
| 4、研究目标和内容 | 第29-30页 |
| ·研究目标 | 第29-30页 |
| ·研究内容 | 第30页 |
| 5、技术路线 | 第30页 |
| 二、材料与方法 | 第30-52页 |
| 1、试验材料 | 第30-34页 |
| ·组织、质粒和菌株 | 第31页 |
| ·主要设备和仪器 | 第31页 |
| ·主要试剂 | 第31页 |
| ·培养基、溶液配制 | 第31-34页 |
| ·配制培养基 | 第31-32页 |
| ·菌体蛋白处理溶液 | 第32页 |
| ·相关溶液和缓冲液配制 | 第32-33页 |
| ·ELISA抗体效价检测相关试剂 | 第33-34页 |
| ·Western blotting实验溶液配制 | 第34页 |
| 2 、实验方法 | 第34-52页 |
| ·引物设计 | 第34-35页 |
| ·猪肺总RNA提取 | 第35-36页 |
| ·扩增完整编码区cDNA | 第36-37页 |
| ·1st cDNA合成 | 第36页 |
| ·完整编码区cDNA的PCR扩增 | 第36-37页 |
| ·目的基因的克隆与鉴定 | 第37-40页 |
| ·连接反应 | 第38页 |
| ·感受态细胞的制备与转化 | 第38-39页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第39页 |
| ·重组菌落培养及测序 | 第39-40页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第40-45页 |
| ·提取克隆重组质粒与pET-30a(+)质粒 | 第40页 |
| ·含Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ限制性酶切位点目的基因片段扩增 | 第40-41页 |
| ·pET-30a(+)质粒和硒蛋白基因的双酶切 | 第41页 |
| ·pET-30a(+)与pMD18-T-TrxR2和pMD18-T-SelH的连接 | 第41-42页 |
| ·TOP10感受态细胞的制备及转化 | 第42页 |
| ·阳性重组子PCR检测及酶切鉴定 | 第42-43页 |
| ·SelH基因定点突变 | 第43-45页 |
| ·重组质粒转入表达菌株及转化子鉴定 | 第45-46页 |
| ·提取表达重组质粒及pET-30a-c(+)空载质粒 | 第45页 |
| ·表达重组质粒及pET-30a-c(+)空载质粒的转化与筛选 | 第45-46页 |
| ·重组子pET-30a(+)-TrxR2与pET-30a(+)-T-SelH的诱导表达及纯化 | 第46-48页 |
| ·重组子的诱导表达 | 第47页 |
| ·重组子表达产物的纯化 | 第47-48页 |
| ·纯化蛋白SDS-PAGE检测 | 第48页 |
| ·抗体制备及检测 | 第48-51页 |
| ·抗体制备 | 第48页 |
| ·抗体采集 | 第48-49页 |
| ·抗体效价的ELISA分析 | 第49-50页 |
| ·抗体的Western blotting检测 | 第50-51页 |
| ·ELISA分析猪体各组织中硒蛋白TrxR2含量 | 第51-52页 |
| ·各组织中总蛋白的提取 | 第51页 |
| ·ELISA分析 | 第51-52页 |
| 三、结果与分析 | 第52-65页 |
| 1、猪硒蛋白基因TrxR2的克隆、表达及抗体制备 | 第52-59页 |
| ·猪TrxR2基因的克隆 | 第52-53页 |
| ·猪肺组织总RNA提取 | 第52页 |
| ·完整TrxR2编码区cDNA的扩增结果 | 第52页 |
| ·TrxR2基因的克隆 | 第52-53页 |
| ·TrxR2编码基因表达载体构建 | 第53-55页 |
| ·含酶切位点TrxR2基因片段的扩增结果 | 第53页 |
| ·pET-30a(+)质粒的双酶切 | 第53-54页 |
| ·阳性克隆PCR检测与酶切鉴定 | 第54-55页 |
| ·E.coli/pET-30a(+)-TrxR2表达菌株的转化与筛选 | 第55-56页 |
| ·PCR检测转化子 | 第55页 |
| ·TrxR2在E.coli中的表达 | 第55页 |
| ·TrxR2在E.coli中的表达产物纯化 | 第55-56页 |
| ·抗体的质量检测 | 第56-59页 |
| ·抗体效价的ELISA分析 | 第56页 |
| ·抗体的Western blotting检测 | 第56-57页 |
| ·ELISA分析猪体各组织中硒蛋白TrxR2含量 | 第57-59页 |
| 2、猪硒蛋白基因SelH的克隆、表达及抗体制备 | 第59-65页 |
| ·猪SelH基因的克隆 | 第59-60页 |
| ·猪肺组织总RNA提取 | 第59页 |
| ·完整SelH编码区cDNA的扩增结果 | 第59页 |
| ·SelH基因的克隆 | 第59-60页 |
| ·SelH编码基因表达载体构建 | 第60-61页 |
| ·pET-30a(+)-SelH阳性克隆PCR检测与酶切鉴定 | 第60-61页 |
| ·pET-30a(+)-SelH基因定点突变 | 第61页 |
| ·E.coli/pET-30a(+)-SelH表达菌株的转化与筛选 | 第61-63页 |
| ·PCR检测转化子 | 第61-62页 |
| ·SelH在E.coli中的表达 | 第62页 |
| ·SelH在E.coli中的表达产物纯化 | 第62-63页 |
| ·抗体的质量检测 | 第63-65页 |
| ·抗体效价的ELISA分析 | 第63页 |
| ·抗体的Western blotting检测 | 第63-64页 |
| ·ELISA分析猪体各组织中硒蛋白SelH含量 | 第64-65页 |
| 四、讨论 | 第65-71页 |
| 1、硒蛋白基因序列的克隆 | 第65-67页 |
| 2、硒蛋白TrxR2和SelH的原核表达及蛋白纯化 | 第67-69页 |
| 3、硒蛋白多克隆抗体制备及效价评价 | 第69-71页 |
| 五、结论与展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 附录一 | 第78页 |
