| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 中英文缩写词表 | 第7-11页 |
| 一、绪论 | 第11-25页 |
| 1、引言 | 第11-12页 |
| 2、文献综述 | 第12-21页 |
| ·概述 | 第12-13页 |
| ·胃蛋白酶的研究进展 | 第13-17页 |
| ·胃蛋白酶及其酶原的结构特征 | 第13页 |
| ·胃蛋白酶原的分类 | 第13-14页 |
| ·胃蛋白酶的性质和功能 | 第14页 |
| ·胃蛋白酶原A在机体生成机制 | 第14-15页 |
| ·胃蛋白酶原A的激活过程 | 第15-16页 |
| ·胃蛋白酶的来源 | 第16页 |
| ·胃蛋白酶基因的克隆和表达 | 第16-17页 |
| ·胃蛋白酶的功能和用途 | 第17-19页 |
| ·胃蛋白酶在饲料工业的应用 | 第17页 |
| ·在皮革工业上的应用 | 第17-18页 |
| ·在酿酒工业中的应用 | 第18-19页 |
| ·在医学领域的应用 | 第19页 |
| ·胃蛋白酶应用中面临的问题 | 第19页 |
| ·巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达体系 | 第19-21页 |
| ·毕赤酵母宿主的优越性 | 第19-20页 |
| ·毕赤酵母的菌株种类及表型 | 第20-21页 |
| 3、立题依据 | 第21-22页 |
| 4、研究目标和内容 | 第22-24页 |
| ·研究目的 | 第22-23页 |
| ·研究内容 | 第23-24页 |
| 5、研究技术路线 | 第24-25页 |
| 二、材料与方法 | 第25-39页 |
| 1、材料和仪器 | 第25-28页 |
| ·材料与试剂 | 第25页 |
| ·试剂 | 第25页 |
| ·主要培养基 | 第25-26页 |
| ·主要溶液 | 第26-27页 |
| ·主要仪器设备 | 第27页 |
| ·引物设计与合成 | 第27-28页 |
| 2、实验方法 | 第28-39页 |
| ·胃蛋白酶原A基因的克隆 | 第28-31页 |
| ·胃组织总RNA的提取 | 第28页 |
| ·基因的扩增 | 第28-29页 |
| ·TA克隆和测序 | 第29-31页 |
| ·P.pastoris/pPICZαA-pepsinogen A表达载体的构建 | 第31-33页 |
| ·含EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点目的基因片段扩增 | 第31页 |
| ·PCR产物和pPICZαA质粒的酶切与连接 | 第31-33页 |
| ·大肠杆菌Top 10感受态细胞的制备、转化与阳性转化子的筛选 | 第33页 |
| ·重组猪胃蛋白酶原A的毕赤酵母x-33转化与表达 | 第33-38页 |
| ·重组表达载体pPICZαA-pep A的线性化 | 第33-34页 |
| ·pPICZαA-pep A重组质粒毕赤酵母的转化与转化子的筛选 | 第34-35页 |
| ·重组酵母基因组PCR检测 | 第35-37页 |
| ·重组猪胃蛋白酶原A的诱导表达 | 第37页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE检测 | 第38页 |
| ·重组胃蛋白酶蛋白活性检测 | 第38-39页 |
| 三、实验结果与分析 | 第39-47页 |
| 1、猪胃蛋白酶原A基因TA克隆 | 第39-40页 |
| ·总RNA的提取与pepsinogen A编码区RT-PCR扩增 | 第39页 |
| ·Pepsinogen A基因TA克隆 | 第39-40页 |
| 2、pPICZαA-pep A重组表达质粒的构建及鉴定 | 第40-42页 |
| ·含酶切位点pepsinogen A基因片段的扩增结果 | 第40-41页 |
| ·pPICZαA质粒的双酶切 | 第41页 |
| ·阳性克隆PCR检测与酶切鉴定 | 第41-42页 |
| 3、P.pastoris/pPICZαA-pep A表达菌株的转化与筛选 | 第42-44页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第42-43页 |
| ·PCR检测转化子 | 第43页 |
| ·定量实时PCR(q RT-PCR)对转化子RNA表达量的检测 | 第43-44页 |
| 4、猪胃蛋白酶原A在P.pastoris中的表达、纯化 | 第44-45页 |
| 5、重组胃蛋白酶原A的酸化处理 | 第45-46页 |
| 6、重组胃蛋白酶蛋白活性检测 | 第46-47页 |
| 四、讨论 | 第47-52页 |
| 1、高mRNA表达胃蛋白酶原A酵母菌株的筛选 | 第47页 |
| 2、毕赤酵母表达系统及pPICZαA表达载体 | 第47-49页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第47-48页 |
| ·pPICZαA表达载体选择 | 第48-49页 |
| 3、胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达 | 第49-51页 |
| 5、重组胃蛋白酶的活性检测 | 第51-52页 |
| 五、结论与展望 | 第52-54页 |
| 1、胃蛋白酶原A提高表达产量的研究 | 第52页 |
| 2、胃蛋白酶原A的激活和活性检测 | 第52页 |
| 3、改造pep A的分子结构提高其活性和稳定性 | 第52-53页 |
| 4、pep A在动物生产中的应用 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 附录一 | 第62-64页 |
| 附录二 | 第64-65页 |
| 附录三 | 第65-66页 |
| 附录四 | 第66页 |
