| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第1章 引言 | 第11-19页 |
| 1.1 泡沫病毒概述 | 第11-12页 |
| 1.2 泡沫病毒的形态特征 | 第12页 |
| 1.3 泡沫病毒的基因组结构 | 第12-13页 |
| 1.4 泡沫病毒基因表达调控 | 第13-16页 |
| 1.4.1 泡沫病毒的启动子 | 第13-14页 |
| 1.4.2 泡沫病毒的反式激活因子Bel1/Tas | 第14-15页 |
| 1.4.3 调节蛋白Bet | 第15-16页 |
| 1.5 泡沫病毒的复制 | 第16-17页 |
| 1.6 泡沫病毒载体 | 第17-18页 |
| 1.7 逆转录病毒滴度检测方法的研究进展 | 第18页 |
| 1.8 本研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 第2章 原型泡沫病毒样品的制备 | 第19-25页 |
| 2.1 实验材料与仪器设备 | 第19-21页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第19-21页 |
| 2.1.2 仪器设备 | 第21页 |
| 2.2 方法 | 第21-24页 |
| 2.2.1 细胞复苏 | 第21页 |
| 2.2.2 细胞传代 | 第21-22页 |
| 2.2.3 原型泡沫病毒感染BHK-21细胞 | 第22页 |
| 2.2.4 原型泡沫病毒样品浓缩 | 第22-23页 |
| 2.2.5 原型泡沫病毒粒子的检测 | 第23-24页 |
| 2.3 结果 | 第24-25页 |
| 第3章 空斑形成试验定量PFV方法的建立 | 第25-31页 |
| 3.1 实验材料与仪器设备 | 第25-26页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第25-26页 |
| 3.1.2 仪器设备 | 第26页 |
| 3.2 实验方法与步骤 | 第26-28页 |
| 3.2.1 细胞复苏 | 第26-27页 |
| 3.2.2 细胞培养及传代 | 第27页 |
| 3.2.3 细胞铺板 | 第27页 |
| 3.2.4 PFV感染HT1080细胞 | 第27-28页 |
| 3.3 结果 | 第28-31页 |
| 第4章 基于SYBR Green Ⅰ的产物增强逆转录酶活定量PFV方法的建立 | 第31-43页 |
| 4.1 实验材料与仪器设备 | 第31-33页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第31-32页 |
| 4.1.2 仪器设备 | 第32-33页 |
| 4.2 方法 | 第33-37页 |
| 4.2.1 引物的设计和合成 | 第33页 |
| 4.2.2 模板MS2 RNA的稀释 | 第33页 |
| 4.2.3 PFV样品的处理 | 第33页 |
| 4.2.4 优化SG-PERT的逆转录反应温度 | 第33-34页 |
| 4.2.5 SG-PERT标准曲线的建立和方法的灵敏度测定 | 第34-35页 |
| 4.2.6 PFV逆转录酶的二价阳离子偏好性及最适浓度的确定 | 第35-36页 |
| 4.2.7 SG-PERT方法的精确性测定 | 第36-37页 |
| 4.3 结果 | 第37-41页 |
| 4.3.1 优化SG-PERT的逆转录反应温度的结果 | 第37-38页 |
| 4.3.2 SG-PERT的标准曲线及方法的灵敏度测定结果 | 第38页 |
| 4.3.3 SG-PERT方法的可重复性测定结果 | 第38-39页 |
| 4.3.4 PFV逆转录酶二价阳离子偏好性及最适浓度的结果 | 第39-40页 |
| 4.3.5 SG-PERT方法的精确性测定结果 | 第40-41页 |
| 4.4 结论 | 第41-43页 |
| 第5章 实时定量PCR技术定量PFV方法的建立 | 第43-71页 |
| 5.1 实验材料与仪器设备 | 第43-45页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第43-45页 |
| 5.1.2 仪器设备 | 第45页 |
| 5.2 方法 | 第45-60页 |
| 5.2.1 引物的设计 | 第45-46页 |
| 5.2.2 标准质粒pMD20T-gag的提取及鉴定 | 第46-47页 |
| 5.2.3 标准质粒pMD19T-401、pMD19T-702的构建 | 第47-52页 |
| 5.2.4 PFV DNA的提取 | 第52-53页 |
| 5.2.5 PFV RNA的提取及检测 | 第53-54页 |
| 5.2.6 pMD20T-gag标准曲线法定量PFV | 第54-57页 |
| 5.2.7 pMD19T401/pMD19T-702标准曲线法定量PFV | 第57-60页 |
| 5.3 结果 | 第60-71页 |
| 5.3.1 标准质粒pMD20T-gag的提取及PCR鉴定结果 | 第60页 |
| 5.3.2 标准质粒pMD19T-401、pMD19T-702的构建结果 | 第60-65页 |
| 5.3.3 pMD20T-gag标准曲线法定量PFV的结果 | 第65-67页 |
| 5.3.4 pMD19T-401/pMD19T-702标准曲线法定量PFV的结果 | 第67-71页 |
| 第6章 LTR-Luc指示细胞系定量PFV方法的建立 | 第71-79页 |
| 6.1 实验材料与仪器设备 | 第71-72页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第71-72页 |
| 6.1.2 仪器设备 | 第72页 |
| 6.2 实验方法与步骤 | 第72-76页 |
| 6.2.1 细胞复苏 | 第72页 |
| 6.2.2 细胞培养及传代 | 第72-73页 |
| 6.2.3 细胞转染及指示细胞系筛选 | 第73-74页 |
| 6.2.4 LTR-Luc指示细胞系对不同感染滴度的PFV的响应 | 第74-75页 |
| 6.2.5 LTR-Luc指示细胞系的荧光素酶活性表达与PFV滴度的相关性 | 第75-76页 |
| 6.3 实验结果 | 第76-79页 |
| 6.3.1 LTR-Luc指示细胞系对不同感染滴度PFV响应的结果 | 第76-77页 |
| 6.3.2 LTR-Luc指示细胞系荧光素酶活性表达与PFV滴度的相关性的结果 | 第77-79页 |
| 第7章 LTR-EGFP指示细胞系定量PFV方法的建立 | 第79-85页 |
| 7.1 实验材料与仪器设备 | 第79-80页 |
| 7.1.1 实验材料 | 第79-80页 |
| 7.1.2 仪器设备 | 第80页 |
| 7.2 实验方法与步骤 | 第80-82页 |
| 7.2.1 细胞复苏、培养及传代 | 第80页 |
| 7.2.2 细胞转染及指示细胞系筛选 | 第80-81页 |
| 7.2.3 LTR-EGFP指示细胞系对pCI-Tas的响应 | 第81页 |
| 7.2.4 LTR-EGFP指示细胞系绿色荧光蛋白表达与病毒滴度的相关性 | 第81-82页 |
| 7.3 实验结果 | 第82-85页 |
| 7.3.1 LTR-EGFP指示细胞系对pCI-Tas的响应 | 第82-83页 |
| 7.3.2 LTR-EGFP指示细胞系EGFP表达与PFV滴度的相关性的结果 | 第83-85页 |
| 第8章 讨论与展望 | 第85-87页 |
| 8.1 讨论 | 第85-86页 |
| 8.2 展望 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第95页 |
