| 摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-35页 |
| 1.1 苹果黑腐皮壳菌及其引致的腐烂病研究进展 | 第18-22页 |
| 1.1.1 苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)的病原学和生物学特征 | 第18-19页 |
| 1.1.2 苹果黑腐皮壳菌(V.mali)的侵染规律 | 第19页 |
| 1.1.3 苹果黑腐皮壳菌(V.mali)的致病机制 | 第19-21页 |
| 1.1.4 苹果黑腐皮壳菌(V.mali)引致的腐烂病的危害及防控 | 第21-22页 |
| 1.2 寄主植物与其病原微生物互作 | 第22-25页 |
| 1.2.1 基因对基因假说(Gene for gene hypothesis) | 第22-23页 |
| 1.2.2 植物与病原互作的zigzag模型(Zigzag model) | 第23-24页 |
| 1.2.3 植物与病原互作的入侵模型(Invasion model) | 第24-25页 |
| 1.3 植物病原效应蛋白研究进展 | 第25-33页 |
| 1.3.1 植物病原效应蛋白的概念范畴 | 第25-26页 |
| 1.3.2 不同植物病原的效应蛋白研究 | 第26-30页 |
| 1.3.3 植物病原效应蛋白的转运机制 | 第30-31页 |
| 1.3.4 植物病原效应蛋白的作用机制 | 第31页 |
| 1.3.5 Hce2功能域的研究进展 | 第31-32页 |
| 1.3.6 Pod功能域的研究进展 | 第32-33页 |
| 1.4 本研究目的及意义 | 第33-35页 |
| 第二章 含Hce2 功能域的效应蛋白VmHEPs通过串联拷贝的冗余互补方式参与致病 | 第35-63页 |
| 2.1 前言 | 第35页 |
| 2.2 试验材料、试剂及仪器 | 第35-36页 |
| 2.2.1 试验菌株与植株 | 第35页 |
| 2.2.2 试验载体、试剂及试验仪器 | 第35-36页 |
| 2.2.3 供试培养基 | 第36页 |
| 2.2.4 试验所用引物 | 第36页 |
| 2.3 试验方法 | 第36-45页 |
| 2.3.1 菌株活化及培养 | 第36页 |
| 2.3.2 互作样RNA提取及反转录cDNA获取 | 第36-37页 |
| 2.3.3 农杆菌介导的本氏烟基因瞬时表达 | 第37-38页 |
| 2.3.4 Western印迹杂交检测 | 第38页 |
| 2.3.5 信号肽外泌功能验证 | 第38-39页 |
| 2.3.6 苹果黑腐皮壳菌原生质体制备 | 第39页 |
| 2.3.7 PEG介导的同源重组基因敲除盒子构建与原生质体转化 | 第39-40页 |
| 2.3.8 转化突变体检测 | 第40-41页 |
| 2.3.9 突变体Southern印迹杂交检测 | 第41-42页 |
| 2.3.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第42-43页 |
| 2.3.11 苹果黑腐皮壳菌突变体致病力检测 | 第43页 |
| 2.3.12 苹果黑腐皮壳菌突变体生长检测 | 第43-44页 |
| 2.3.13 逆转录PCR(RT-PCR) | 第44页 |
| 2.3.14 序列分析方法 | 第44-45页 |
| 2.4 结果与分析 | 第45-60页 |
| 2.4.1 效应蛋白VmHEPs的挖掘和鉴定 | 第45-46页 |
| 2.4.2 VmHEPs基因及其Hce2功能域的系统发育分析及选择压力分析 | 第46-49页 |
| 2.4.3 五个VmHEPs基因中仅VmHEP1能引起坏死 | 第49-50页 |
| 2.4.4 VmHEPs的信号肽具有分泌功能 | 第50-51页 |
| 2.4.5 VmHEP1与VmHEP2在侵染时显著上调 | 第51-52页 |
| 2.4.6 五个VmHEPs的单基因敲除突变体的PCR检测及Southern杂交确认. | 第52-53页 |
| 2.4.7 VmHEPs单基因敲除未影响致病力 | 第53-55页 |
| 2.4.8 突变体qRT-PCR显示侵染时VmHEP1与VmHEP2基因功能冗余互补 | 第55-56页 |
| 2.4.9 VmHEP1与VmHEP2的双基因敲除突变体的PCR检测及Southern杂交确认 | 第56-57页 |
| 2.4.10 VmHEP1与VmHEP2双基因敲除突变体致病力显著下降 | 第57-58页 |
| 2.4.11 VmHEP1与VmHEP2不是V.mali生长必需因子 | 第58-60页 |
| 2.5 讨论 | 第60-63页 |
| 第三章 效应蛋白VmHEP1上游非编码区的启动功能验证及互作靶标筛选鉴定 | 第63-79页 |
| 3.1 前言 | 第63页 |
| 3.2 试验材料、仪器 | 第63-64页 |
| 3.2.1 试验菌株与植株 | 第63-64页 |
| 3.2.2 试验载体、试验试剂及仪器 | 第64页 |
| 3.2.3 供试培养基 | 第64页 |
| 3.2.4 试验所用引物 | 第64页 |
| 3.3 试验方法 | 第64-68页 |
| 3.3.1 菌株活化及培养 | 第64页 |
| 3.3.2 互作样RNA提取及反转录cDNA获取 | 第64页 |
| 3.3.3 农杆菌介导的本氏烟体系基因瞬时表达 | 第64页 |
| 3.3.4 苹果黑腐皮壳菌原生体制备 | 第64-65页 |
| 3.3.5 PEG介导的同源重组基因敲除盒子构建与原生质体转化 | 第65页 |
| 3.3.6 待筛启动子在V.mali中的启动功能验证 | 第65页 |
| 3.3.7 逆转录PCR(RT-PCR) | 第65页 |
| 3.3.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第65页 |
| 3.3.9 酵母双杂交试验(Yeast two hybrid,Y2H) | 第65-66页 |
| 3.3.10 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP) | 第66-67页 |
| 3.3.11 银染蛋白胶及质谱测序 | 第67页 |
| 3.3.12 质谱结果(Raw data)比库分析 | 第67页 |
| 3.3.13 病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS) | 第67页 |
| 3.3.14 电解质渗出率检测 | 第67-68页 |
| 3.4 结果与分析 | 第68-76页 |
| 3.4.1 含不同启动子的外源GFP转基因转化菌株获取及PCR检测验证 | 第68页 |
| 3.4.2 VmHEP1基因上游1500bp片段具有启动基因的功能 | 第68-70页 |
| 3.4.3 VmHEP1基因上游1500bp启动功能受侵染诱导 | 第70页 |
| 3.4.4 酵母双杂交(Y2H)筛选VmHEP1互作靶标 | 第70-71页 |
| 3.4.5 VmHEP1与候选靶标全长序列在酵母体系中的互作验证 | 第71-72页 |
| 3.4.6 免疫共沉淀(Co-IP)与聚丙烯酰胺凝胶快速银染技术获取待测特异互作样 | 第72-73页 |
| 3.4.7 质谱分析验证效应蛋白VmHEP1与MdLRRP1结合 | 第73-74页 |
| 3.4.8 TRV介导的VIGS沉默MdLRRP1在本氏烟中的同源基因NbSERK | 第74-75页 |
| 3.4.9 在NbSERK3被沉默的本氏烟中VmHEP1引起的坏死程度显著降低 | 第75-76页 |
| 3.5 讨论 | 第76-79页 |
| 第四章 含Pod保守功能域的效应蛋白VmPODs的鉴定和功能研究 | 第79-94页 |
| 4.1 前言 | 第79页 |
| 4.2 试验材料、试剂及仪器 | 第79-80页 |
| 4.2.1 试验菌株与植株 | 第79-80页 |
| 4.2.2 试验载体、试剂及试验仪器 | 第80页 |
| 4.2.3 供试培养基 | 第80页 |
| 4.2.4 试验所用引物 | 第80页 |
| 4.3 试验方法 | 第80-81页 |
| 4.3.1 菌株活化及培养 | 第80页 |
| 4.3.2 互作样RNA提取及反转录cDNA获取 | 第80页 |
| 4.3.3 信号肽外泌功能验证 | 第80页 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第80页 |
| 4.3.5 电解质渗出率检测 | 第80页 |
| 4.3.6 苹果黑腐皮壳菌原生质体制备 | 第80页 |
| 4.3.7 PEG介导的同源重组基因敲除盒子构建与原生质体转化 | 第80页 |
| 4.3.8 转化突变体检测 | 第80页 |
| 4.3.9 突变体Southern印迹杂交检测 | 第80页 |
| 4.3.10 苹果黑腐皮壳菌突变体基因回补 | 第80-81页 |
| 4.3.11 苹果黑腐皮壳菌突变体生长检测 | 第81页 |
| 4.3.12 苹果黑腐皮壳菌突变体致病力检测 | 第81页 |
| 4.3.13 序列分析方法 | 第81页 |
| 4.4 结果与分析 | 第81-92页 |
| 4.4.1 VmPODs挖掘及氨基酸序列分析 | 第81-83页 |
| 4.4.2 三个VmPODs的信号肽具有分泌功能 | 第83页 |
| 4.4.3 三个VmPODs基因在侵染时显著上调 | 第83-84页 |
| 4.4.4 VmPODs显著降低INF-1在本氏烟叶片中引起的细胞坏死程度 | 第84-85页 |
| 4.4.5 三个VmPODs基因敲除突变体和回补突变体的PCR检测及Southern杂交确认 | 第85-87页 |
| 4.4.6 VmPODs基因敲除突变体的产孢能力显著降低 | 第87-89页 |
| 4.4.7 VmPODs基因敲除突变体对环境中H_2O_2的抗胁迫能力显著降低 | 第89页 |
| 4.4.8 VmPODs基因敲除突变体中的?VmPOD3致病性显著降低 | 第89-90页 |
| 4.4.9 VmPODs同源蛋白广泛存在于其它植物病原真菌 | 第90-92页 |
| 4.5 讨论 | 第92-94页 |
| 第五章 全文结论与展望 | 第94-96页 |
| 5.1 全文结论 | 第94-95页 |
| 5.2 展望 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-110页 |
| 附录 | 第110-129页 |
| 附录A 本研究中所使用试剂配方 | 第110-112页 |
| 附录B 本研究中所使用培养基配方 | 第112-114页 |
| 附录C 第二章研究中使用的引物以及VmHEPs序列分析信息 | 第114-126页 |
| 附录D 第三章研究中使用的引物 | 第126-127页 |
| 附录E 第四章研究中使用的引物 | 第127-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
| 作者简介 | 第130页 |
