| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 引言 | 第11-19页 |
| 1.1 琥珀酸的工业价值 | 第11页 |
| 1.2 琥珀酸的代谢改造 | 第11-12页 |
| 1.3 转录水平调控 | 第12-14页 |
| 1.3.1 全局转录因子Cra | 第12-13页 |
| 1.3.2 全局转录机器工程 | 第13-14页 |
| 1.4 定向进化 | 第14-15页 |
| 1.4.1 突变菌株库的构建方法 | 第14-15页 |
| 1.4.2 突变菌株的筛选方法 | 第15页 |
| 1.5 转录因子调控方式解析 | 第15-17页 |
| 1.6 本研究的意义与主要内容 | 第17-19页 |
| 第2章 琥珀酸高产菌株的筛选 | 第19-38页 |
| 2.1 前言 | 第19页 |
| 2.2 材料与方法 | 第19-28页 |
| 2.2.1 本章所用菌株与质粒 | 第19-20页 |
| 2.2.2 本章所用引物 | 第20-21页 |
| 2.2.3 试剂 | 第21页 |
| 2.2.4 培养基和培养条件 | 第21-22页 |
| 2.2.5 分子克隆操作 | 第22-25页 |
| 2.2.6 突变菌株库的构建 | 第25-26页 |
| 2.2.7 琥珀酸高产菌的筛选 | 第26-27页 |
| 2.2.8 发酵参数的检测 | 第27-28页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第28-36页 |
| 2.3.1 易错PCR对Cra进行随机突变,构建突变菌株库 | 第28页 |
| 2.3.2 高产菌株的快速筛选 | 第28-31页 |
| 2.3.3 高产菌株的反应器发酵 | 第31-34页 |
| 2.3.4 整合菌株的反应器发酵 | 第34-36页 |
| 2.4 本章小结 | 第36-38页 |
| 第3章 琥珀酸代谢关键基因表达及酶活分析 | 第38-53页 |
| 3.1 前言 | 第38页 |
| 3.2 材料与方法 | 第38-44页 |
| 3.2.1 酶活检测 | 第38-40页 |
| 3.2.2 基因表达水平的检测 | 第40-44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-51页 |
| 3.3.1 mRNA的提取与反转录 | 第44-46页 |
| 3.3.2 Cra所调控碳代谢关键基因表达情况及关键酶酶活 | 第46-51页 |
| 3.4 本章小结 | 第51-53页 |
| 第4章 全局转录因子Cra对琥珀酸调控机制解析 | 第53-68页 |
| 4.1 前言 | 第53页 |
| 4.2 材料与方法 | 第53-59页 |
| 4.2.1 表达载体的构建 | 第53-54页 |
| 4.2.2 蛋白的表达 | 第54页 |
| 4.2.3 蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| 4.2.4 WesternBlot检测蛋白的表达 | 第55-56页 |
| 4.2.5 EMSA实验检测蛋白质与DNA结合能力 | 第56-57页 |
| 4.2.6 ITC实验检测蛋白质与配体结合能力 | 第57-59页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第59-67页 |
| 4.3.1 突变Cra结构模拟 | 第59-61页 |
| 4.3.2 Cra蛋白的表达与纯化 | 第61-64页 |
| 4.3.3 ITC实验测定配体FBP与Cra的结合能力 | 第64-65页 |
| 4.3.4 EMSA实验解析Cra与DNA的结合情况 | 第65-67页 |
| 4.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 第5章 总结与展望 | 第68-72页 |
| 5.1 总结 | 第68-69页 |
| 5.1.1 构建产琥珀酸大肠杆菌基因工程菌 | 第68页 |
| 5.1.2 关键酶活及关键基因表达分析 | 第68页 |
| 5.1.3 ITC实验分析FBP与Cra的结合能力 | 第68页 |
| 5.1.4 EMSA实验分析DNA与Cra的结合能力 | 第68-69页 |
| 5.2 展望 | 第69-72页 |
| 5.2.1 增强C3到C4的代谢通量 | 第69-70页 |
| 5.2.2 利用生物质资源生产琥珀酸大 | 第70页 |
| 5.2.3 结合系统生物学寻找新的靶点基因 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
