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大肠杆菌全局转录因子Cra对琥珀酸生物合成的调控机制研究

摘要第4-6页
Abstract第6-7页
第1章 引言第11-19页
    1.1 琥珀酸的工业价值第11页
    1.2 琥珀酸的代谢改造第11-12页
    1.3 转录水平调控第12-14页
        1.3.1 全局转录因子Cra第12-13页
        1.3.2 全局转录机器工程第13-14页
    1.4 定向进化第14-15页
        1.4.1 突变菌株库的构建方法第14-15页
        1.4.2 突变菌株的筛选方法第15页
    1.5 转录因子调控方式解析第15-17页
    1.6 本研究的意义与主要内容第17-19页
第2章 琥珀酸高产菌株的筛选第19-38页
    2.1 前言第19页
    2.2 材料与方法第19-28页
        2.2.1 本章所用菌株与质粒第19-20页
        2.2.2 本章所用引物第20-21页
        2.2.3 试剂第21页
        2.2.4 培养基和培养条件第21-22页
        2.2.5 分子克隆操作第22-25页
        2.2.6 突变菌株库的构建第25-26页
        2.2.7 琥珀酸高产菌的筛选第26-27页
        2.2.8 发酵参数的检测第27-28页
    2.3 结果与讨论第28-36页
        2.3.1 易错PCR对Cra进行随机突变,构建突变菌株库第28页
        2.3.2 高产菌株的快速筛选第28-31页
        2.3.3 高产菌株的反应器发酵第31-34页
        2.3.4 整合菌株的反应器发酵第34-36页
    2.4 本章小结第36-38页
第3章 琥珀酸代谢关键基因表达及酶活分析第38-53页
    3.1 前言第38页
    3.2 材料与方法第38-44页
        3.2.1 酶活检测第38-40页
        3.2.2 基因表达水平的检测第40-44页
    3.3 结果与讨论第44-51页
        3.3.1 mRNA的提取与反转录第44-46页
        3.3.2 Cra所调控碳代谢关键基因表达情况及关键酶酶活第46-51页
    3.4 本章小结第51-53页
第4章 全局转录因子Cra对琥珀酸调控机制解析第53-68页
    4.1 前言第53页
    4.2 材料与方法第53-59页
        4.2.1 表达载体的构建第53-54页
        4.2.2 蛋白的表达第54页
        4.2.3 蛋白的纯化第54-55页
        4.2.4 WesternBlot检测蛋白的表达第55-56页
        4.2.5 EMSA实验检测蛋白质与DNA结合能力第56-57页
        4.2.6 ITC实验检测蛋白质与配体结合能力第57-59页
    4.3 结果与讨论第59-67页
        4.3.1 突变Cra结构模拟第59-61页
        4.3.2 Cra蛋白的表达与纯化第61-64页
        4.3.3 ITC实验测定配体FBP与Cra的结合能力第64-65页
        4.3.4 EMSA实验解析Cra与DNA的结合情况第65-67页
    4.4 本章小结第67-68页
第5章 总结与展望第68-72页
    5.1 总结第68-69页
        5.1.1 构建产琥珀酸大肠杆菌基因工程菌第68页
        5.1.2 关键酶活及关键基因表达分析第68页
        5.1.3 ITC实验分析FBP与Cra的结合能力第68页
        5.1.4 EMSA实验分析DNA与Cra的结合能力第68-69页
    5.2 展望第69-72页
        5.2.1 增强C3到C4的代谢通量第69-70页
        5.2.2 利用生物质资源生产琥珀酸大第70页
        5.2.3 结合系统生物学寻找新的靶点基因第70-72页
参考文献第72-76页
致谢第76页

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