| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 中英文缩写词对照表 | 第12-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-29页 |
| 1.1 引言 | 第13-14页 |
| 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第14-18页 |
| 1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介 | 第14-15页 |
| 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统优势 | 第15-17页 |
| 1.2.3 巴斯德毕赤酵母主要缺陷 | 第17-18页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母碳源阻遏机制研究 | 第18-26页 |
| 1.3.1 碳源阻遏现象 | 第18-19页 |
| 1.3.2 巴斯德毕赤酵母葡萄糖抑制信号通路 | 第19-21页 |
| 1.3.3 巴斯德毕赤酵母转录因子研究 | 第21-26页 |
| 1.4 立题依据及意义 | 第26-29页 |
| 第二章 巴斯德毕赤酵母中甘油转运体鉴定 | 第29-51页 |
| 2.1 前言 | 第29-30页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第30-38页 |
| 2.2.1 菌株质粒 | 第30-31页 |
| 2.2.2 培养基 | 第31-32页 |
| 2.2.3 分子以及化学试剂 | 第32-33页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第33页 |
| 2.2.5 主要溶液 | 第33-34页 |
| 2.2.6 实验方法 | 第34-38页 |
| 2.3 实验结果 | 第38-48页 |
| 2.3.1 巴斯德毕赤酵母中甘油转运体(glycerol transporter1,GLT1)生物信息学分析 | 第38-39页 |
| 2.3.2 甘油转运体Glt1p亚细胞定位载体构建及其亚细胞定位结果 | 第39-41页 |
| 2.3.3 甘油转运体异源回补实验载体构建及Glt1p蛋白功能验证 | 第41-43页 |
| 2.3.4 甘油转运体(GLT1)基因敲除盒构建及GLT1基因缺失突变体构建 | 第43-44页 |
| 2.3.5 GLT1基因缺失突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母中AOX1基因mRNA相对表达量测定 | 第44-45页 |
| 2.3.6 GLT1缺失突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母在不同培养基中生长曲线以及Aox1p酶活测定 | 第45-46页 |
| 2.3.7 Western-blotting测定GLT1缺失突变体以及野生型中Aox1p蛋白表达量 | 第46-47页 |
| 2.3.8 GLT1缺失突变体以及野生型菌株中甘油代谢速率测定 | 第47-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-49页 |
| 2.5 本章小结 | 第49-51页 |
| 第三章 Mxr1p和Glt1p在甘油抑制PAOX1途径中相互作用 | 第51-75页 |
| 3.1 前言 | 第51-52页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第52-56页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第52-53页 |
| 3.2.2 培养基 | 第53-54页 |
| 3.2.3 分子以及化学试剂 | 第54页 |
| 3.2.4 主要仪器 | 第54页 |
| 3.2.5 主要溶液 | 第54页 |
| 3.2.6 实验方法 | 第54-56页 |
| 3.3 实验结果 | 第56-72页 |
| 3.3.1 MXR1敲除载体以及缺失突变体构建 | 第56-57页 |
| 3.3.2 MXR1过表达载体以及菌株构建 | 第57-59页 |
| 3.3.3 GLT1过表达载体以及菌株构建 | 第59-60页 |
| 3.3.4 GLT1基因在野生型以及不同突变体中mRNA相对表达量测定 | 第60页 |
| 3.3.5 MXR1基因在野生型以及不同突变体中mRNA相对表达量测定 | 第60-61页 |
| 3.3.6 AOX1基因在野生型以及不同突变体中mRNA相对表达量测定 | 第61-64页 |
| 3.3.7 野生型以及不同突变体中Aox1p酶活测定 | 第64-65页 |
| 3.3.8 Western方法测定Aox1p蛋白在野生型以及不同突变体中蛋白表达量 | 第65-67页 |
| 3.3.9 野生型以及不同突变体细胞中甘油含量测定 | 第67-68页 |
| 3.3.10 Mxr1p蛋白表达菌株构建及蛋白纯化 | 第68-69页 |
| 3.3.11 Mxr150AA蛋白与PGLT1相互作用凝胶迁移率(EMSA)实验 | 第69-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-73页 |
| 3.5 本章小结 | 第73-75页 |
| 第四章 甲醇代谢通路中与Mxr1p互作蛋白的挖掘 | 第75-93页 |
| 4.1 前言 | 第75-76页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第76-81页 |
| 4.2.1 菌株及质粒 | 第76-77页 |
| 4.2.2 培养基 | 第77页 |
| 4.2.3 分子以及化学试剂 | 第77页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第77-78页 |
| 4.2.5 主要溶液 | 第78页 |
| 4.2.6 实验方法 | 第78-81页 |
| 4.3 实验结果 | 第81-90页 |
| 4.3.1 Mxr150AA表达纯化 | 第81页 |
| 4.3.2 Mxr400AA表达纯化 | 第81-82页 |
| 4.3.3 Pulldown寻找与Mxr150/400AA蛋白相互作用蛋白 | 第82-84页 |
| 4.3.4 酵母双杂交BD载体构建 | 第84页 |
| 4.3.5 酵母双杂交AD载体构建 | 第84-86页 |
| 4.3.6 Mxr150/400AA酵母双杂交结果 | 第86-87页 |
| 4.3.7 MUT pathway基因在不同碳源条件下转录水平测定 | 第87-89页 |
| 4.3.8 Mxr1p蛋白与Tkl1p蛋白在甲醛同化进程中功能 | 第89-90页 |
| 4.4 讨论 | 第90-91页 |
| 4.5 本章小结 | 第91-93页 |
| 第五章 新型巴斯德毕赤酵母表达系统构建及功能评价 | 第93-105页 |
| 5.1 前言 | 第93-94页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第94-96页 |
| 5.2.1 菌株及质粒 | 第94-95页 |
| 5.2.2 培养基 | 第95-96页 |
| 5.2.3 分子以及化学试剂 | 第96页 |
| 5.2.4 主要仪器 | 第96页 |
| 5.2.5 主要溶液 | 第96页 |
| 5.2.6 实验方法 | 第96页 |
| 5.3 实验结果 | 第96-102页 |
| 5.3.1 Hsap表达载体以及表达菌株构建 | 第96-97页 |
| 5.3.2 Egfpp表达载体以及表达菌株构建 | 第97-98页 |
| 5.3.3 △glt1突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母Egfpp摇瓶外源蛋白表达 | 第98-100页 |
| 5.3.4 △glt1突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母Hsap摇瓶外源蛋白表达 | 第100-101页 |
| 5.3.5 △glt1突变体以及野生型巴斯德毕赤酵母Hsap发酵罐外源蛋白表达 | 第101-102页 |
| 5.4 讨论 | 第102-103页 |
| 5.5 本章小结 | 第103-105页 |
| 主要结论与展望 | 第105-109页 |
| 论文创新点 | 第109-111页 |
| 致谢 | 第111-113页 |
| 参考文献 | 第113-123页 |
| 附录 | 第123页 |
