| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 引言 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-33页 |
| 1.1 山羊乳腺发育与泌乳研究进展 | 第17-22页 |
| 1.1.1 羊奶与人类的营养 | 第17页 |
| 1.1.2 乳腺发育与乳的形成 | 第17-18页 |
| 1.1.3 泌乳相关重要调控基因和调控通路 | 第18-22页 |
| 1.2 miRNA特征及作用机制 | 第22-27页 |
| 1.2.1 miRNA的发现及生物学合成 | 第22-23页 |
| 1.2.2 miRNA的生物学作用机制 | 第23-24页 |
| 1.2.3 miRNA的靶基因鉴定方法 | 第24-25页 |
| 1.2.4 miRNA与lncRNA | 第25-27页 |
| 1.3 miRNA在家畜育种的研究进展 | 第27-29页 |
| 1.4 miRNA遗传变异的效应 | 第29-30页 |
| 1.5 乳品中miRNA的研究 | 第30-31页 |
| 1.6 本研究的目的意义 | 第31-33页 |
| 第二章 奶山羊乳腺组织小RNA测序及miRNA的鉴定 | 第33-50页 |
| 2.1 材料与方法 | 第33-37页 |
| 2.1.1 试验动物及组织样品的采集 | 第33页 |
| 2.1.2 RNA的提取与质量检测 | 第33-34页 |
| 2.1.3 小分子RNA的cDNA文库构建 | 第34-35页 |
| 2.1.4 文库的检测和高通量测序 | 第35-36页 |
| 2.1.5 测序结果生物信息学分析 | 第36-37页 |
| 2.2 结果与分析 | 第37-47页 |
| 2.2.1 总RNA提取和检测结果 | 第37-38页 |
| 2.2.2 小RNA文库的Solexa测序 | 第38-39页 |
| 2.2.3 小RNA的生物信息学分析 | 第39-43页 |
| 2.2.4 保守miRNA和新miRNA的鉴定 | 第43-47页 |
| 2.3 讨论 | 第47-49页 |
| 2.3.1 关于miRNA的鉴定方法 | 第47页 |
| 2.3.2 泌乳中期与干奶期乳腺组织中小RNA文库的差异 | 第47-48页 |
| 2.3.3 保守miRNA | 第48页 |
| 2.3.4 新的候选miRNA | 第48-49页 |
| 2.4 小结 | 第49-50页 |
| 第三章 奶山羊乳腺组织miRNA的验证研究 | 第50-62页 |
| 3.1 材料与方法 | 第50-56页 |
| 3.1.1 试验动物及组织样品的采集 | 第50页 |
| 3.1.2 RNA的提取与cDNA的合成 | 第50-51页 |
| 3.1.3 miRNA的选取和引物设计 | 第51-54页 |
| 3.1.4 山羊miRNA前体序列PCR克隆与测序 | 第54-55页 |
| 3.1.5 山羊miRNA前体序列分析 | 第55-56页 |
| 3.1.6 山羊miRNA分子的克隆与检测 | 第56页 |
| 3.2 结果与分析 | 第56-60页 |
| 3.2.1 pre-miRNA山羊与牛序列同源性比较 | 第56页 |
| 3.2.2 山羊pre-miRNA二级结构信息分析 | 第56-59页 |
| 3.2.3 山羊miRNA分子的克隆鉴定 | 第59-60页 |
| 3.3 讨论 | 第60-61页 |
| 3.3.1 牛和山羊的序列同源性 | 第60页 |
| 3.3.2 miRNA同源物种间的保守性 | 第60-61页 |
| 3.3.3 miRNA分子检测 | 第61页 |
| 3.4 小结 | 第61-62页 |
| 第四章 乳腺生理相关miRNA的筛选、功能预测及表达谱分析 | 第62-84页 |
| 4.1 材料与方法 | 第63-66页 |
| 4.1.1 试验动物及组织样品的采集 | 第63页 |
| 4.1.2 RNA的提取与cDNA的合成 | 第63页 |
| 4.1.3 筛选差异表达miRNA分析 | 第63页 |
| 4.1.4 miRNA的stem-loop RT-PCR定量分析 | 第63-65页 |
| 4.1.5 比较各物种中高表达miRNA异同 | 第65页 |
| 4.1.6 比较乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA异同 | 第65页 |
| 4.1.7 miRNA靶基因的预测 | 第65-66页 |
| 4.1.8 靶基因的功能注释 | 第66页 |
| 4.2 结果与分析 | 第66-78页 |
| 4.2.1 miRNA差异表达分析 | 第66-68页 |
| 4.2.2 差异表达的miRNA时空表达分析 | 第68-73页 |
| 4.2.3 各物种中高表达miRNA比较 | 第73-74页 |
| 4.2.4 乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA的比较 | 第74-75页 |
| 4.2.5 miRNA靶基因分析 | 第75页 |
| 4.2.6 靶基因的GO和Pathway分析 | 第75-78页 |
| 4.3 讨论 | 第78-83页 |
| 4.3.1 差异miRNA的比较分析 | 第78-79页 |
| 4.3.2 各物种中高表达miRNA比较分析 | 第79-80页 |
| 4.3.3 乳腺组织中miRNA与乳汁中miRNA比较分析 | 第80-81页 |
| 4.3.4 miRNA靶基因分析 | 第81-82页 |
| 4.3.5 靶基因功能分析 | 第82-83页 |
| 4.4 小结 | 第83-84页 |
| 第五章 奶山羊miR-2478靶基因的初步鉴定 | 第84-104页 |
| 5.1 材料与方法 | 第85-92页 |
| 5.1.1 试验材料 | 第85页 |
| 5.1.2 乳腺组织总RNA提取及cDNA的合成 | 第85页 |
| 5.1.3 靶基因的预测 | 第85页 |
| 5.1.4 靶基因对应山羊序列的扩增与验证 | 第85-86页 |
| 5.1.5 靶序列野生型与突变型psiCHECK-2载体构建 | 第86-90页 |
| 5.1.6 HEK293T细胞培养与传代培养 | 第90-91页 |
| 5.1.7 HEK293T细胞的转染 | 第91页 |
| 5.1.8 双荧光素酶报告检测 | 第91页 |
| 5.1.9 统计分析 | 第91-92页 |
| 5.2 结果与分析 | 第92-101页 |
| 5.2.1 靶基因的预测 | 第92-93页 |
| 5.2.2 对应山羊靶基因序列的扩增与比对 | 第93-94页 |
| 5.2.3 野生型psiCHECK-2载体构建与鉴定 | 第94-96页 |
| 5.2.4 突变型psiCHECK-2载体构建与鉴定 | 第96-97页 |
| 5.2.5 psiCHECK-2载体测序验证 | 第97页 |
| 5.2.6 HEK293T细胞培养转染 | 第97-98页 |
| 5.2.7 不同靶序列与miR-2478作用验证结果 | 第98-101页 |
| 5.3 讨论 | 第101-103页 |
| 5.3.1 miRNA靶基因的预测方法 | 第101页 |
| 5.3.2 Overlap PCR定点突变基因的方法 | 第101-102页 |
| 5.3.3 miRNA靶基因的验证 | 第102-103页 |
| 5.4 小结 | 第103-104页 |
| 第六章 miR-2478靶向TGFβ1基因机制分析 | 第104-112页 |
| 6.1 材料与方法 | 第104-106页 |
| 6.1.1 试验材料 | 第104页 |
| 6.1.2 TGFβ1基因5’侧翼区系列缺失载体的构建 | 第104-105页 |
| 6.1.3 HEK293T细胞培养与传代培养 | 第105页 |
| 6.1.4 HEK293T细胞的转染 | 第105页 |
| 6.1.5 双荧光素酶报告检测 | 第105页 |
| 6.1.6 统计分析 | 第105页 |
| 6.1.7 TGFβ1基因5’侧翼区的生物信息学分析 | 第105-106页 |
| 6.2 结果与分析 | 第106-110页 |
| 6.2.1 TGFβ1基因5’侧翼区系列缺失载体的构建及鉴定 | 第106-107页 |
| 6.2.2 TGFβ1基因5’侧翼区系列缺失质粒转录活性测定 | 第107-108页 |
| 6.2.3 TGFβ1基因5’侧翼区转录调控位点分析 | 第108-109页 |
| 6.2.4 TGFβ1基因5’侧翼区甲基化分析 | 第109页 |
| 6.2.5 TGFβ1基因启动子特征序列分析 | 第109-110页 |
| 6.3 讨论 | 第110-111页 |
| 6.3.1 miRNA靶向5’UTR和CDS区 | 第110页 |
| 6.3.2 TGFβ1基因启动子的调控模式 | 第110-111页 |
| 6.4 小结 | 第111-112页 |
| 第七章 泌乳相关miRNA和相关基因遗传变异研究 | 第112-124页 |
| 7.1 材料与方法 | 第112-114页 |
| 7.1.1 试验材料 | 第112-113页 |
| 7.1.2 主要试剂和仪器 | 第113页 |
| 7.1.3 DNA提取和DNA池测序扫描基因的多态性 | 第113页 |
| 7.1.4 PCR-RFLP检测突变在群体中的分布 | 第113页 |
| 7.1.5 miR-2478突变体与靶序列互作分析 | 第113-114页 |
| 7.1.6 数据处理 | 第114页 |
| 7.2 结果与分析 | 第114-121页 |
| 7.2.1 山羊基因组DNA样品的检测 | 第114-115页 |
| 7.2.2 多态的筛选与鉴定 | 第115页 |
| 7.2.3 多态的PCR-RFLP或PCR检测 | 第115-118页 |
| 7.2.4 遗传变异的关联分析 | 第118-120页 |
| 7.2.5 miR-2478突变体与靶序列互作分析 | 第120-121页 |
| 7.3 讨论 | 第121-123页 |
| 7.3.1 PrRP,miR-196a,miR-431和miR-2478基因变异效应 | 第121-122页 |
| 7.3.2 miR-2478成熟体的突变对靶基因的效应分析 | 第122-123页 |
| 7.4 小结 | 第123-124页 |
| 第八章 结论与创新点 | 第124-126页 |
| 8.1 结论 | 第124-125页 |
| 8.2 创新点 | 第125页 |
| 8.3 进一步的研究内容 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-139页 |
| 附录 | 第139-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
| 作者简介 | 第149页 |
