| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第8-15页 |
| 第一部分 文献综述及选题目的意义 | 第15-19页 |
| 第一章 疱疹病毒UL45基因及其编码蛋白研究进展 | 第15-19页 |
| 1 鸭病毒性肠炎概述 | 第15页 |
| 2 疱疹病毒UL45基因研究进展 | 第15-17页 |
| ·UL45结构特点 | 第15页 |
| ·UL45保守性 | 第15-16页 |
| ·UL45蛋白结构 | 第16页 |
| ·UL45转录表达时相 | 第16页 |
| ·UL45蛋白的功能 | 第16-17页 |
| ·作为装配病毒粒子组件 | 第16页 |
| ·对细胞-细胞融合的影响 | 第16-17页 |
| ·对病毒生长复制和释放的影响 | 第17页 |
| ·对病毒毒力的影响 | 第17页 |
| ·抗细胞凋亡功能 | 第17页 |
| 3 展望 | 第17-18页 |
| 4 选题目的及意义 | 第18-19页 |
| 第二部分 试验研究 | 第19-73页 |
| 第二章 鸭肠炎病毒UL45基因的分子特性分析 | 第19-33页 |
| 1 材料与方法 | 第19-20页 |
| ·材料 | 第19页 |
| ·基因文库 | 第19页 |
| ·主要生物信息学分析软件 | 第19页 |
| ·方法 | 第19-20页 |
| ·核酸序列的分子特性分析 | 第19页 |
| ·蛋白质序列的分子特性分析 | 第19-20页 |
| ·密码子偏嗜性分析 | 第20页 |
| 2 结论 | 第20-32页 |
| ·核酸序列分子特性分析 | 第20-22页 |
| ·蛋白质序列的分子特性分析 | 第22-28页 |
| ·UL45基因的密码子偏爱性分析 | 第28-29页 |
| ·DEV UL45的密码子与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性比较 | 第29-32页 |
| 3 讨论 | 第32-33页 |
| 第三章 DEV UL45和UL45Δ基因的克隆及验证 | 第33-44页 |
| 1 材料与方法 | 第33-36页 |
| ·毒株、菌株及载体 | 第33页 |
| ·主要试剂 | 第33页 |
| ·主要溶液的配制 | 第33-36页 |
| ·制备鸭胚成纤维细胞相关溶液 | 第33-34页 |
| ·抽提核酸相关溶液 | 第34页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳相关溶液 | 第34页 |
| ·细菌培养相关溶液 | 第34页 |
| ·斑点杂交相关溶液 | 第34-36页 |
| 2 试验方法 | 第36-40页 |
| ·DEV UL45和UL45Δ基因的克隆 | 第36-38页 |
| ·引物设计 | 第36页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的制备 | 第36页 |
| ·DEV接种鸭胚成纤维单层细胞及种毒的制备 | 第36-37页 |
| ·病毒基因组DNA的提取 | 第37页 |
| ·DEV UL45和UL45Δ基因的PCR扩增 | 第37-38页 |
| ·UL45和UL45Δ基因的T-载体克隆及鉴定 | 第38-39页 |
| ·UL45和UL45Δ基因的T-载体克隆 | 第38-39页 |
| ·重组质粒pMD18-UL45和pMD18-UL45Δ的鉴定 | 第39页 |
| ·斑点杂交检测DEV UL45基因 | 第39-40页 |
| ·探针的设计 | 第39页 |
| ·核酸探针特异性检测 | 第39-40页 |
| ·斑点杂交步骤 | 第40页 |
| 3 结果 | 第40-42页 |
| ·鸭肠炎病毒UL45和UL45Δ基因的扩增 | 第40-41页 |
| ·UL45和UL45Δ基因的T-克隆与鉴定 | 第41-42页 |
| ·斑点杂交试验 | 第42页 |
| 4. 讨论 | 第42-44页 |
| 第四章 UL45和UL45Δ基因原核表达及多克隆抗体制备 | 第44-60页 |
| 1 材料 | 第44页 |
| ·毒株、菌株和载体 | 第44页 |
| ·试验动物及主要试剂 | 第44页 |
| ·主要溶液配制 | 第44页 |
| 2 主要操作步骤 | 第44-52页 |
| ·UL45和UL45Δ基因重组表达菌株的构建 | 第45-48页 |
| ·重组克隆质粒及表达质粒pET-32a(+)的提取、酶切 | 第45-46页 |
| ·目的DNA片段的回收 | 第46页 |
| ·制备感受态细胞DH5α和BL21(DE3)PLysS | 第46页 |
| ·pET-32a(+)与UL45和UL45Δ片段的连接 | 第46-47页 |
| ·重组表达质粒转化感受态细胞DH5a | 第47页 |
| ·转化菌落的鉴定 | 第47-48页 |
| ·工程菌的表达形式分析及条件优化 | 第48-49页 |
| ·重组表达菌株的培养及表达 | 第48页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第48页 |
| ·诱导时间的优化 | 第48页 |
| ·诱导温度的优化 | 第48页 |
| ·表达形式分析 | 第48-49页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第49页 |
| ·样品制备(可溶性蛋白) | 第49页 |
| ·镍NTA琼脂糖凝胶FF过柱纯化重组蛋白 | 第49页 |
| ·盐析纯化UL45Δ蛋白 | 第49页 |
| ·多克隆抗体制备及效价检测 | 第49-50页 |
| ·重组蛋白疫苗的制备 | 第49页 |
| ·免疫程序 | 第49-50页 |
| ·琼脂糖扩散试验检测重组蛋白多克隆抗体的效价 | 第50页 |
| ·抗体IgG粗提和纯化 | 第50-51页 |
| ·硫酸铵粗提兔抗UL45Δ IgG | 第50-51页 |
| ·High-Q阴离子交换层析纯化兔抗UL45Δ IgG | 第51页 |
| ·免疫兔血清的Western-Blot检测 | 第51-52页 |
| 3 结果 | 第52-57页 |
| ·UL45和UL45Δ基因表达载体及表达菌的构建 | 第52页 |
| ·重组蛋白在大肠杆菌中的表达及分布 | 第52-53页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第53-54页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第53页 |
| ·诱导时间的优化 | 第53-54页 |
| ·诱导温度的优化 | 第54页 |
| ·表达蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| ·抗血清的效价测定 | 第55页 |
| ·兔抗UL45Δ IgG的纯化及SDS-PAGE鉴定 | 第55-56页 |
| ·Western blot检测 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-60页 |
| ·载体及表达系统的选择 | 第57页 |
| ·UL45蛋白表达失败原因分析 | 第57-58页 |
| ·优化诱导条件 | 第58页 |
| ·蛋白纯化 | 第58-60页 |
| 第五章 UL45基因的转录时相研究 | 第60-70页 |
| 1 材料 | 第60页 |
| ·主要试剂 | 第60页 |
| ·主要仪器 | 第60页 |
| 2 试验方法 | 第60-63页 |
| ·荧光定量PCR引物的设计和合成 | 第60-61页 |
| ·引物的特异性检测 | 第61页 |
| ·实时荧光定量PCR标准曲线的制作 | 第61-62页 |
| ·荧光定量PCR cDNA模板的制备 | 第62页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的培养与病毒感染 | 第62页 |
| ·细胞总RNA的提取及其完整性和纯度测定 | 第62页 |
| ·逆转录 | 第62页 |
| ·实时荧光定量PCR反应 | 第62-63页 |
| ·统计分析 | 第63页 |
| 3 结果 | 第63-68页 |
| ·荧光定量PCR引物的验证 | 第63-64页 |
| ·RNA完整性及纯度分析 | 第64页 |
| ·SYBR Green Ⅰ real-time PCR标准曲线的建立及线形范围 | 第64-66页 |
| ·DEV感染DEF后UL45基因的转录变化 | 第66-68页 |
| 4 讨论 | 第68-70页 |
| ·转录时相的研究方法 | 第68-69页 |
| ·病毒UL45基因转录时相分析 | 第69-70页 |
| 第六章 UL45基因产物结构蛋白分析 | 第70-73页 |
| 1 试验材料 | 第70页 |
| ·试验试剂及配制 | 第70页 |
| ·试验器材 | 第70页 |
| 2 试验方法 | 第70-71页 |
| ·结构蛋白的验证 | 第70-71页 |
| ·蛋白属性分析 | 第71页 |
| 3 试验结果 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-73页 |
| ·病毒的纯化 | 第72页 |
| ·蛋白属性分析 | 第72-73页 |
| 第三部分 结论 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第84页 |
| 攻读硕士学位期间以第一作者身份发表的论文 | 第84页 |
| 参加研究课题情况 | 第84页 |
