| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 缩略语 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-21页 |
| 1 家蚕SP2的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.1 贮藏蛋白的研究 | 第14页 |
| 1.2 SP2的结构与特性 | 第14-15页 |
| 1.3 SP2的功能研究 | 第15页 |
| 2 星孢菌素诱导细胞凋亡的研究进展 | 第15-17页 |
| 2.1 星孢菌素的来源 | 第15-16页 |
| 2.2 星孢菌素诱导细胞凋亡的研究 | 第16-17页 |
| 3 血管内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化的研究进展 | 第17-19页 |
| 3.1 血管内皮细胞的生理功能 | 第17页 |
| 3.2 血管内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化 | 第17-18页 |
| 3.3 抗内皮细胞凋亡药物的研究 | 第18-19页 |
| 4 杆状病毒表达系统 | 第19页 |
| 5 研究展望 | 第19-21页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第21-24页 |
| 1 实验目的、意义 | 第21页 |
| 2 实验内容 | 第21-23页 |
| 3 实验流程图 | 第23-24页 |
| 第三章 家蚕SP2的生物信息学分析 | 第24-30页 |
| 1 生物信息学工具 | 第24页 |
| 2 方法 | 第24页 |
| 3 结果 | 第24-29页 |
| 3.1 家蚕sp2基因的序列分析 | 第24-26页 |
| 3.2 家蚕SP2的疏水性分析 | 第26页 |
| 3.3 家蚕SP2的信号肽分析 | 第26-27页 |
| 3.4 家蚕SP2的跨膜区分析 | 第27页 |
| 3.5 家蚕SP2的亚细胞定位分析 | 第27-28页 |
| 3.6 家蚕SP2的二级结构预测 | 第28页 |
| 3.7 家蚕SP2的三级结构预测 | 第28-29页 |
| 4 讨论 | 第29-30页 |
| 第四章 家蚕sp2基因的原核表达、纯化和多克隆抗体制备 | 第30-49页 |
| 1 材料与试剂 | 第30-35页 |
| 1.1 材料 | 第30页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第30-35页 |
| 2 方法 | 第35-44页 |
| 2.1 sp2基因的PCR扩增 | 第35-36页 |
| 2.2 重组质粒pET-28a(+)-sp2的构建 | 第36-37页 |
| 2.2.1 碱裂解法制备质粒 | 第36页 |
| 2.2.2 纯化的目的基因sp2和pET-28a(+)的双酶切 | 第36-37页 |
| 2.2.3 连接反应 | 第37页 |
| 2.3 用CaCl_2法制备E.coli TG1、BL21 (DE3)感受态细胞 | 第37-38页 |
| 2.4 连接产物的转化 | 第38页 |
| 2.5 重组质粒的筛选和鉴定 | 第38-39页 |
| 2.5.1 筛选阳性克隆 | 第38页 |
| 2.5.2 质粒的小量制备 | 第38页 |
| 2.5.3 PCR鉴定 | 第38页 |
| 2.5.4 双酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 2.5.5 重组质粒的测序鉴定 | 第39页 |
| 2.6 重组质粒的转化及鉴定 | 第39页 |
| 2.7 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第39页 |
| 2.8 蛋白凝胶电泳检测 | 第39-40页 |
| 2.9 融合蛋白的纯化 | 第40-41页 |
| 2.9.1 包涵体的溶解与蛋白样品制备 | 第40-41页 |
| 2.9.2 镍柱亲和层析纯化融合蛋白 | 第41页 |
| 2.10 抗体制备 | 第41-44页 |
| 2.10.1 抗原的制备 | 第41-42页 |
| 2.10.2 免疫动物 | 第42页 |
| 2.10.3 多克隆抗血清的制备 | 第42页 |
| 2.10.4 抗体效价测定 | 第42-43页 |
| 2.10.5 Western blot检测抗体的特异性 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-47页 |
| 3.1 PCR扩增目的基因片段 | 第44页 |
| 3.2 重组质粒pET-28a(+)-sp2鉴定 | 第44-45页 |
| 3.3 序列测定 | 第45页 |
| 3.4 重组质粒pET-28a(+)-sp2在大肠杆菌中的诱导表达 | 第45-46页 |
| 3.5 融合蛋白的纯化 | 第46页 |
| 3.6 多克隆抗体效价的测定 | 第46-47页 |
| 3.7 融合蛋白的Western blot分析 | 第47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 第五章 家蚕SP2的组织定位及亚细胞定位 | 第49-55页 |
| 1 材料与试剂 | 第49-51页 |
| 1.1 材料 | 第49页 |
| 1.2 试剂 | 第49-50页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-52页 |
| 2.1 家蚕各时期和五龄幼虫各组织中总蛋白的提取及定量 | 第51页 |
| 2.2 Western blot分析SP2在家蚕各时期和五龄幼虫各组织中的分布 | 第51页 |
| 2.3 亚细胞定位 | 第51-52页 |
| 3 结果 | 第52-54页 |
| 3.1 SP2在家蚕各发育时期的分布情况 | 第52页 |
| 3.2 SP2在家蚕五龄幼虫各组织中的分布情况 | 第52-53页 |
| 3.3 SP2的亚细胞定位分析 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 第六章 sp2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及纯化 | 第55-65页 |
| 1 材料与试剂 | 第55-56页 |
| 1.1 材料 | 第55页 |
| 1.2 试剂 | 第55页 |
| 1.3 试剂配制 | 第55-56页 |
| 2 方法 | 第56-61页 |
| 2.1 重组病毒Bacmid-sp2的构建 | 第56-59页 |
| 2.1.1 重组转移载体pFastBac HTB-sp2的构建 | 第56页 |
| 2.1.2 DH10Bac菌感受态的制备 | 第56-57页 |
| 2.1.3 重组质粒pFastBac HTB-sp2的转化 | 第57页 |
| 2.1.4 阳性克隆的筛选 | 第57页 |
| 2.1.5 Bacmid-sp2基因组DNA的提取 | 第57-58页 |
| 2.1.6 重组病毒Bacmid-sp2的PCR鉴定 | 第58-59页 |
| 2.2 家蚕BmN细胞的培养与冻存、复苏 | 第59-60页 |
| 2.2.1 细胞冻存 | 第59页 |
| 2.2.2 细胞复苏 | 第59页 |
| 2.2.3 家蚕BmN细胞贴壁培养 | 第59-60页 |
| 2.3 脂质体介导的Bacmid-sp2基因组DNA转染家蚕BmN细胞 | 第60页 |
| 2.4 病毒滴度测定(终点稀释法) | 第60-61页 |
| 2.5 目的蛋白SP2在家蚕BmN细胞中的表达 | 第61页 |
| 2.6 Western blot鉴定蛋白表达 | 第61页 |
| 2.7 融合蛋白的纯化 | 第61页 |
| 3 结果 | 第61-64页 |
| 3.1 重组转移载体pFastBac HTB-sp2的鉴定 | 第61-62页 |
| 3.2 重组病毒Bacmid-sp2的PCR鉴定 | 第62-63页 |
| 3.3 病毒滴度测定 | 第63页 |
| 3.4 融合蛋白在家蚕BmN细胞中的表达、纯化及Western blot鉴定 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-65页 |
| 第七章 家蚕SP2的抗凋亡功能研究 | 第65-74页 |
| 1 材料和试剂 | 第65页 |
| 1.1 材料与设备 | 第65页 |
| 1.2 试剂 | 第65页 |
| 1.3 试剂的配制 | 第65页 |
| 2 方法 | 第65-68页 |
| 2.1 HUVEC细胞的冻存、复苏与贴壁培养 | 第65-66页 |
| 2.2 STS诱导HUVEC凋亡模型的建立 | 第66页 |
| 2.3 SP2处理经STS诱导凋亡的HUVEC细胞 | 第66页 |
| 2.4 MTT法检测SP2对STS诱导凋亡的HUVEC活力的影响 | 第66-67页 |
| 2.5 Cell Death Detection ELISA试剂盒检测SP2的抗凋亡作用 | 第67页 |
| 2.6 AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测SP2的抗凋亡作用 | 第67-68页 |
| 3 结果与分析 | 第68-72页 |
| 3.1 HUVEC凋亡模型的建立 | 第68-69页 |
| 3.2 SP2对STS诱导凋亡的HUVEC活力的影响 | 第69-70页 |
| 3.3 SP2对STS诱导凋亡的HUVEC DNA片段化的影响 | 第70-71页 |
| 3.4 流式细胞仪检测SP2的抗凋亡作用 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-74页 |
| 结论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
