| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-21页 |
| 1.1 S-腺苷甲硫氨酸的生理功能 | 第10-14页 |
| 1.1.1 转甲基作用 | 第10-11页 |
| 1.1.2 转硫基作用 | 第11页 |
| 1.1.3 转氨丙基作用 | 第11-12页 |
| 1.1.4 S-腺苷甲硫氨酸的临床应用 | 第12-13页 |
| 1.1.5 S-腺苷甲硫氨酸的稳定性 | 第13-14页 |
| 1.2 S-腺苷甲硫氨酸的生产方法 | 第14-15页 |
| 1.2.1 化学合成法 | 第14页 |
| 1.2.2 酶促转化法 | 第14页 |
| 1.2.3 微生物发酵法 | 第14-15页 |
| 1.3 SAM合成酶 | 第15-17页 |
| 1.3.1 大肠杆菌（Escherichia coli）SAM合成酶 | 第16页 |
| 1.3.2 酵母SAM合成酶 | 第16页 |
| 1.3.3 哺乳动物SAM合成酶 | 第16-17页 |
| 1.3.4 其它来源的SAM合成酶 | 第17页 |
| 1.4 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）及其SAM合成途径 | 第17-19页 |
| 1.5 本论文主要研究内容 | 第19-21页 |
| 1.5.1 立题依据和研究意义 | 第19页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 不同来源SAM合成酶在E. coli和C. glutamicum中表达和活性比较 | 第21-35页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 材料和方法 | 第21-29页 |
| 2.2.1 菌株 | 第21-23页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 | 第24-25页 |
| 2.2.4 分子生物学操作 | 第25-27页 |
| 2.2.5 重组菌的蛋白表达分析 | 第27-28页 |
| 2.2.6 酶活测定分析 | 第28页 |
| 2.2.7 发酵参数测定 | 第28页 |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR | 第28-29页 |
| 2.3 结果和分析 | 第29-33页 |
| 2.3.1 不同来源的SAM合成酶蛋白序列比对分析 | 第29-30页 |
| 2.3.2 不同来源的SAM合成酶表达载体的构建 | 第30页 |
| 2.3.3 不同来源的SAM合成酶在E. coli JM109中诱导表达 | 第30-31页 |
| 2.3.4 三种不同野生型C. glutamicum合成SAM能力的比对 | 第31-32页 |
| 2.3.5 S. cerevisiae和C. glutamicum来源的SAM合成酶在C. glutamicum中诱导表达 | 第32页 |
| 2.3.6 RT-PCR和SDS-PAGE确定SAM2失活的原因 | 第32-33页 |
| 2.4 讨论 | 第33-34页 |
| 2.5 本章小结 | 第34-35页 |
| 第三章S. cerevisiae来源的SAM2基因的优化以及酶学性质研究 | 第35-46页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 材料和方法 | 第35-38页 |
| 3.2.1 菌株、质粒及相关引物 | 第35-36页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第36页 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 | 第36页 |
| 3.2.4 分子生物学操作 | 第36页 |
| 3.2.5 发酵参数测定 | 第36-37页 |
| 3.2.6 重组菌的蛋白表达分析及分离纯化 | 第37页 |
| 3.2.7 纯化后酶酶活的测定 | 第37-38页 |
| 3.3 结果和分析 | 第38-44页 |
| 3.3.1 S. cerevisiae来源的SAM合成酶密码子优化 | 第38-40页 |
| 3.3.2 SAM2优化基因SAM2C在C. glutamicum中诱导表达 | 第40-41页 |
| 3.3.3 ATCC 13032/pDXW8metK和ATCC 13032/pDXW8SAM2C分批补料发酵 | 第41页 |
| 3.3.4 优化后S. cerevisiae来源的SAM合成酶和C. glutamicum来源的SAM合成酶表达载体构建 | 第41-42页 |
| 3.3.5 两种蛋白的纯化及蛋白的SDS-PAGE分析 | 第42-43页 |
| 3.3.6 两种蛋白的最适反应pH和温度分析 | 第43-44页 |
| 3.3.7 两种酶的动力学常数分析 | 第44页 |
| 3.4 讨论 | 第44-45页 |
| 3.5 本章小结 | 第45-46页 |
| 第四章 由野生型C. glutamicum ATCC 13032构建从头合成SAM的菌株 | 第46-61页 |
| 4.1 引言 | 第46页 |
| 4.2 材料和方法 | 第46-51页 |
| 4.2.1 菌株、质粒及相关引物 | 第46-48页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第48页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第48页 |
| 4.2.4 分子生物学操作 | 第48-50页 |
| 4.2.5 发酵参数测定 | 第50-51页 |
| 4.3 结果和分析 | 第51-58页 |
| 4.3.1 相关表达和敲除质粒的构建 | 第51-52页 |
| 4.3.2 通过敲除metB和Ncgl2640基因可以显著降低异亮氨酸的合成同时提高SAM的积累 | 第52-53页 |
| 4.3.3 关键酶表达载体的构建 | 第53-54页 |
| 4.3.4 在WHQ104中过量表达metK和vgb可以进一步提高SAM的积累 | 第54页 |
| 4.3.5 在WHQ104菌表达metYX和hommlyscm可以提高SAM合成 | 第54-55页 |
| 4.3.6 在WHQ104串联表达metK-vgb，metYX，homm-lysCm对SAM合成的影响 | 第55-56页 |
| 4.3.7 在WHQ104/pJYW4metK-vgb中添加甲硫氨酸和腺嘌呤对SAM积累的影响 | 第56-57页 |
| 4.3.8 WHQ104/pJYW4metK-vgb和WHQ104/pJYW4metK-vgb-metYX-hommlyscm的补料分批发酵 | 第57-58页 |
| 4.4 讨论 | 第58-60页 |
| 4.5 本章小结 | 第60-61页 |
| 第五章 构建SAM和异亮氨酸联产的C. glutamicum | 第61-74页 |
| 5.1 引言 | 第61页 |
| 5.2 材料和方法 | 第61-64页 |
| 5.2.1 菌株、质粒及相关引物 | 第61-63页 |
| 5.2.2 试剂和仪器 | 第63页 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 | 第63页 |
| 5.2.4 分子生物学操作 | 第63-64页 |
| 5.2.5 重组菌的蛋白表达分析 | 第64页 |
| 5.2.6 重组菌的酶活分析 | 第64页 |
| 5.2.7 发酵参数测定 | 第64页 |
| 5.3 结果和分析 | 第64-72页 |
| 5.3.1 表达载体的构建 | 第64-65页 |
| 5.3.2 在IWJ001中过量表达metK可以显著提高胞内的SAM产量 | 第65-66页 |
| 5.3.3 过量表达vgb基因有利于提高IWJ001胞内SAM的水平 | 第66-67页 |
| 5.3.4 辅因子基因过量表达对IWJ001胞内SAM的水平的影响 | 第67页 |
| 5.3.5 IWJ001/pDXW8metK-vgb相关蛋白表达及酶活情况 | 第67-68页 |
| 5.3.6 添加甲硫氨酸和腺苷可以提高IWJ001/pDXW8metK-vgb内SAM产量 | 第68-69页 |
| 5.3.7 共表达SAM2C和vgb可以提高IWJ001胞内SAM的水平 | 第69-70页 |
| 5.3.8 共表达homm和lysCm可以提高异亮氨酸产量 | 第70页 |
| 5.3.9 IWJ001/pDXW8metK-vgb的分批补料发酵 | 第70-72页 |
| 5.4 讨论 | 第72-73页 |
| 5.5 本章小结 | 第73-74页 |
| 主要结论与展望 | 第74-76页 |
| 论文主要创新点 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-86页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第86页 |
