| 摘要 | 第11-14页 |
| ABSTRACT | 第14-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-61页 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展 | 第17-51页 |
| 1 病毒的发现和流行 | 第17页 |
| 2 病毒特征 | 第17-19页 |
| 2.1 基本特性 | 第17-18页 |
| 2.2 病毒感染和复制 | 第18-19页 |
| 2.3 病毒传播 | 第19页 |
| 3 病毒非结构蛋白 | 第19-22页 |
| 4 病毒结构蛋白 | 第22-27页 |
| 4.1 核衣壳蛋白(N) | 第22-23页 |
| 4.2 M蛋白 | 第23页 |
| 4.3 主要的糖基化囊膜蛋白GP5 | 第23-25页 |
| 4.4 糖基化蛋白GP2a | 第25页 |
| 4.5 E蛋白 | 第25-26页 |
| 4.6 病毒糖基化囊膜蛋白GP3蛋白 | 第26-27页 |
| 4.7 小的糖基化病毒蛋白GP4 | 第27页 |
| 5 获得性免疫 | 第27-28页 |
| 5.1 体液免疫 | 第27-28页 |
| 5.2 细胞免疫 | 第28页 |
| 6 先天性免疫应答 | 第28-35页 |
| 6.1 PRRSV抑制猪体和培养细胞干扰素的产生 | 第28-30页 |
| 6.2 影响干扰素表达的PRRSV蛋白 | 第30-31页 |
| 6.3 不同毒株对干扰素表达的影响 | 第31-32页 |
| 6.4 PRRSV复制干扰了IFN激活的JAK/STAT信号通路 | 第32-33页 |
| 6.5 PRRSV对干扰素刺激基因功能的影响 | 第33-35页 |
| 参考文献 | 第35-51页 |
| 第二章 Viperin蛋白的抗病毒作用 | 第51-61页 |
| 1 Viperin蛋白的基本结构特征和生物学特性 | 第51页 |
| 2 Viperin蛋白的表达调控 | 第51-52页 |
| 2.1 干扰素依赖的Viperin的表达 | 第51-52页 |
| 2.2 干扰素不依赖的Viperin的表达 | 第52页 |
| 3 Viperin在细胞内的定位 | 第52-53页 |
| 4 Viperin蛋白的抗病毒作用 | 第53-55页 |
| 5 Viperin在先天性免疫中的作用 | 第55-56页 |
| 5.1 Viperin对病毒诱导干扰素的表达的影响 | 第55页 |
| 5.2 Viperin对Th1和Th2的分化和成熟具有促进作用 | 第55-56页 |
| 6 结语 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-61页 |
| 第二部分 实验部分 | 第61-159页 |
| 第三章 Viperin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与抗体的制备 | 第61-85页 |
| 1 材料与方法 | 第62-72页 |
| 1.1 菌株、细胞与载体 | 第62页 |
| 1.2 试剂 | 第62-63页 |
| 1.3 Viperin基因的克隆 | 第63-67页 |
| 1.3.1 引物设计合成 | 第63页 |
| 1.3.2 IFN-α处理Marc-145、PK细胞 | 第63页 |
| 1.3.3 细胞总RNA的提取 | 第63-64页 |
| 1.3.4 猪、猴cDNA的合成 | 第64页 |
| 1.3.5 猪、猴Viperin基因的纯化并与克隆载体连接 | 第64-65页 |
| 1.3.6 连接产物转化Trans 1-T1感受态细胞 | 第65页 |
| 1.3.7 重组质粒鉴定 | 第65-66页 |
| 1.3.8 重组质粒提取 | 第66页 |
| 1.3.9 测序分析 | 第66-67页 |
| 1.4 猪Viperin基因表达载体的构建及多克隆抗体制备 | 第67-72页 |
| 1.4.1 引物的设计与合成 | 第67页 |
| 1.4.2 PCR扩增 | 第67页 |
| 1.4.3 目的片段与pET-28a+原核表达载体的连接 | 第67-68页 |
| 1.4.4 感受态的制备和转化 | 第68页 |
| 1.4.5 重组质粒的鉴定 | 第68-69页 |
| 1.4.6 猪Viperin蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第69-70页 |
| 1.4.7 包涵体的纯化 | 第70页 |
| 1.4.8 Viperin多克隆抗体的制备 | 第70-71页 |
| 1.4.9 Western-blot检测抗体特异性 | 第71页 |
| 1.4.10 IFA检测抗体特异性 | 第71-72页 |
| 2 结果 | 第72-80页 |
| 2.1 PCR扩增结果 | 第72-73页 |
| 2.2 pEASY-MV、SV重组质粒菌液PCR鉴定 | 第73-74页 |
| 2.3 猪和猴Viperin基因的序列测定与同源性分析 | 第74-76页 |
| 2.4 Viperin蛋白表达载体的构建与蛋白表达 | 第76-78页 |
| 2.4.1 猪Viperin氨基酸的抗原性分析 | 第76-77页 |
| 2.4.2 RT-PCR结果 | 第77-78页 |
| 2.4.3 原核表达载体pET-sVIP酶切鉴定 | 第78页 |
| 2.5 猪Viperin蛋白后半段191-362位氨基酸在大肠杆菌的表达 | 第78-79页 |
| 2.6 蛋白的纯化 | 第79页 |
| 2.7 猪Viperin蛋白多克隆抗体制备及抗体的鉴定 | 第79-80页 |
| 2.7.1 间接免疫荧光实验(IFA) | 第79-80页 |
| 2.7.2 Western-blot | 第80页 |
| 3 讨论 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-85页 |
| 第四章 猴Viperin抑制PRRSV复制及其分子机制 | 第85-123页 |
| 1 材料与方法 | 第87-96页 |
| 1.1 质粒、菌株、病毒、试剂 | 第87页 |
| 1.2 引物设计与合成 | 第87-89页 |
| 1.3 RNA提取与cDNA合成 | 第89页 |
| 1.4 PCR扩增目的片段 | 第89页 |
| 1.5 真核表达载体pVAX-mVIP、5'△8、5'△10、5'△12、5'△17、 5'△33、3'△143的构建与表达 | 第89-91页 |
| 1.5.1 目的片段、载体的酶切与回收 | 第89-90页 |
| 1.5.2 连接真核表达载体pVAX-1 | 第90页 |
| 1.5.3 转化 | 第90-91页 |
| 1.5.4 酶切鉴定 | 第91页 |
| 1.6 转染 | 第91页 |
| 1.7 病毒的增殖与滴度测定 | 第91-92页 |
| 1.8 间接免疫荧光(IFA)[41] | 第92页 |
| 1.9 mViperin、IRF-1基因SYBR Green I实时PCR监测方法的建立 | 第92-93页 |
| 1.9.1 引物的设计合成 | 第92页 |
| 1.9.2 荧光定量PCR方法的建立 | 第92-93页 |
| 1.10 mViperin干扰片段的设计、合成及其干扰效果 | 第93-94页 |
| 1.10.1 干扰片段的设计合成 | 第93页 |
| 1.10.2 干扰效果的检测 | 第93-94页 |
| 1.11 Western-bolting | 第94页 |
| 1.11.1 BCA方法测定蛋白浓度 | 第94页 |
| 1.11.2 SDS-PAGE | 第94页 |
| 1.11.3 转印 | 第94页 |
| 1.11.4 Western-bolt | 第94页 |
| 1.12 激光共聚焦检测mViperin与GP5、N、Calnexin蛋白的共定位 | 第94-95页 |
| 1.13 免疫共沉淀试验检测mViperin与PRRSV GP5、N蛋白的相互作用 | 第95页 |
| 1.14 Marc-145细胞上过表达mViperin对PRRSV入胞的影响[42] | 第95-96页 |
| 1.15 Marc-145细胞上过表达mViperin对PRRSV装配与释放的影响[43] | 第96页 |
| 1.16 Marc-145细胞上过表达mViperin对PRRSV基因组复制、转录和翻译的影响 | 第96页 |
| 2 结果 | 第96-113页 |
| 2.1 目的片段PCR扩增 | 第96-97页 |
| 2.2 表达载体pVAX-mVIP、5'△8、5'△10、5'△12,、5'△17、5'△33、3'△143的鉴定 | 第97页 |
| 2.3 mViperin基因SYBR GreenI实时PCR检测方法的建立 | 第97-100页 |
| 2.3.1 PCR扩增体系的优化 | 第97页 |
| 2.3.2 引物扩增的特异性和敏感性 | 第97-99页 |
| 2.3.3 重复性试验 | 第99-100页 |
| 2.4 IFN-α诱导mViperin基因在Marc-145细胞的上调及其抗病毒作用 | 第100-101页 |
| 2.5 PRRSV诱导IRF-1和mViperin基因在Marc-145细胞的上调 | 第101-103页 |
| 2.6 过表达mViperin以剂量依赖方式抑制PRRSV在Marc-145细胞的复制 | 第103-104页 |
| 2.7 特异性siRNA干扰mViperin破坏了IFN-α对PRRSV的抑制作用 | 第104-105页 |
| 2.8 过表达mViperin抑制PRRSV的入胞 | 第105-106页 |
| 2.9 过表达mViperin对PRRSV的装配与释放无抑制作用 | 第106-107页 |
| 2.10 过表达mViperin对PRRSV基因的复制、转录、翻译的影响 | 第107-108页 |
| 2.11 mViperin与PRRSV GP5和N蛋白在Marc-145细胞存在共定位 | 第108-110页 |
| 2.12 mViperin定位于内质网 | 第110页 |
| 2.13 mViperin与PRRSV N蛋白在Marc-145细胞上存在相互作用,但与GP5蛋白无直接相互作用 | 第110-111页 |
| 2.14 mViperin抑制PRRSV复制作用的活性区段定位 | 第111-112页 |
| 2.15 mViperin及其突变体在Marc-145细胞内的分布 | 第112-113页 |
| 3 讨论 | 第113-116页 |
| 参考文献 | 第116-123页 |
| 第五章 猪Viperin重组腺病毒的构建与鉴定 | 第123-139页 |
| 1 材料与方法 | 第124-130页 |
| 1.1 质粒、菌株、细胞 | 第124页 |
| 1.2 主要试剂 | 第124页 |
| 1.3 引物设计与PCR扩增 | 第124页 |
| 1.4 PCR扩增猪Viperin基因 | 第124-125页 |
| 1.5 PCR产物纯化回收 | 第125页 |
| 1.6 穿梭载体pAdTrack-mVIP的构建 | 第125-127页 |
| 1.6.1 PCR产物的酶切与回收 | 第125页 |
| 1.6.2 穿梭载体酶切与回收 | 第125-126页 |
| 1.6.3 连接与转化 | 第126页 |
| 1.6.4 重组质粒的制备 | 第126页 |
| 1.6.5 酶切鉴定 | 第126页 |
| 1.6.6 序列分析 | 第126-127页 |
| 1.7 重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中的同源重组 | 第127-128页 |
| 1.7.1 重组质粒pAdTrack-sVIP的线性化 | 第127页 |
| 1.7.2 大肠杆菌BJ5183感受态细胞的制备 | 第127页 |
| 1.7.3 电转化 | 第127页 |
| 1.7.4 重组质粒的提取 | 第127-128页 |
| 1.7.5 重组质粒的酶切鉴定 | 第128页 |
| 1.8 重组腺病毒的获得 | 第128-129页 |
| 1.8.1 重组腺病毒质粒rAD-sVIP的线性化 | 第128-129页 |
| 1.8.2 转染与腺病毒的传代收获 | 第129页 |
| 1.9 表达sViperin蛋白的重组腺病毒的鉴定 | 第129-130页 |
| 1.9.1 RT-PCR鉴定腺病毒 | 第129页 |
| 1.9.2 Western-blot鉴定 | 第129-130页 |
| 1.10 重组腺病毒滴度的测定 | 第130页 |
| 2 结果 | 第130-134页 |
| 2.1 猪Viperin基因PCR扩增结果 | 第130-131页 |
| 2.2 腺病毒穿梭载体pAdTrack-sVIP的构建与鉴定 | 第131页 |
| 2.3 测序与分析 | 第131页 |
| 2.4 腺病毒重组质粒pAd-sVIP的鉴定 | 第131-132页 |
| 2.5 重组腺病毒质粒的转染与病毒收获 | 第132-133页 |
| 2.6 重组腺病毒rAd-sVIP的外源基因表达与鉴定 | 第133-134页 |
| 2.6.1 RT-PCR检测目的片段 | 第133-134页 |
| 2.6.2 Western-blot鉴定腺病毒外源基因的表达 | 第134页 |
| 2.7 重组腺病毒的传代与滴度测定 | 第134页 |
| 3 讨论 | 第134-136页 |
| 参考文献 | 第136-139页 |
| 第六章 猪Viperin蛋白抑制PRRSV复制作用 | 第139-159页 |
| 1 材料与方法 | 第140-145页 |
| 1.1 质粒、菌株、病毒、试剂 | 第140页 |
| 1.2 引物设计与合成 | 第140页 |
| 1.3 PCR扩增和回收 | 第140-141页 |
| 1.4 pCI-sVIP表达载体的构建 | 第141-142页 |
| 1.4.1 目的片段和载体酶切 | 第141-142页 |
| 1.4.2 连接与转化 | 第142页 |
| 1.4.3 质粒提取与鉴定 | 第142页 |
| 1.5 病毒的增殖与滴度测定 | 第142页 |
| 1.6 Western-bolting | 第142-143页 |
| 1.7 激光共聚焦检测sViperin与PRRSV GP5、N、Calnexin在Marc-145细胞内的共定位 | 第143页 |
| 1.8 免疫共沉淀实验检测sViperin与PRRSV GP5、N在Marc-145细胞内的相互作用 | 第143-144页 |
| 1.9 腺病毒表达sViperin对PRRSV的抑制作用 | 第144页 |
| 1.10 在Marc-145细胞上过表达sViperin对PRRSV入胞的影响 | 第144页 |
| 1.11 Marc-145细胞上过表达sViperin对PRRSV装配与释放的影响 | 第144-145页 |
| 2 结果 | 第145-153页 |
| 2.1 PCR扩增 | 第145页 |
| 2.2 pCI-sVIP重组质粒的酶切鉴定 | 第145-146页 |
| 2.3 过表达sViperin以剂量依赖的方式在Marc-145细胞抑制PRRSV复制 | 第146-147页 |
| 2.4 过表达sViperin在Marc-145细胞抑制了PRRSV的入胞 | 第147页 |
| 2.5 过表达sViperin对病毒的装配与释放无抑制作用 | 第147-149页 |
| 2.6 sViperin与PRRSV GP5和N蛋白在Marc-145细胞存在共定位 | 第149-150页 |
| 2.7 sViperin可定位于内质网 | 第150页 |
| 2.8 过表达sViperin与PRRSV N蛋白在Marc-145细胞上存在相互作用,但与GP5蛋白无相互作用 | 第150-151页 |
| 2.9 腺病毒在PAMSs细胞上过表达sViperin对PRRSV抑制作用 | 第151-153页 |
| 3 讨论 | 第153-155页 |
| 参考文献 | 第155-159页 |
| 全文总结 | 第159-161页 |
| 致谢 | 第161-163页 |
| 已发论文 | 第163页 |
