| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 第一章 研究背景 | 第15-31页 |
| 1 前言 | 第15页 |
| 2 锑的理化性质和毒性 | 第15-16页 |
| 3 锑的应用、来源与污染 | 第16-17页 |
| 4 锑的研究现状 | 第17-18页 |
| 5 锑的生物转化 | 第18-27页 |
| 5.1 锑的转运 | 第19-21页 |
| 5.2 锑的还原 | 第21-22页 |
| 5.3 锑的甲基化 | 第22-23页 |
| 5.4 锑的氧化 | 第23-27页 |
| 5.4.1 锑氧化细菌的多样性 | 第24-25页 |
| 5.4.2 细菌砷氧化与锑氧化之间的相关性 | 第25-27页 |
| 6 细菌的氧化压力及其防御机制 | 第27-29页 |
| 7 微生物对锑的压力响应 | 第29页 |
| 8 本研究的目的与意义 | 第29-31页 |
| 第二章 材料与方法 | 第31-51页 |
| 1 实验材料 | 第31-36页 |
| 1.1 实验菌株及其突变和互补菌株 | 第31页 |
| 1.2 培养条件及试剂 | 第31-36页 |
| 1.3 技术路线 | 第36页 |
| 2 实验方法 | 第36-51页 |
| 2.1 新型锑氧化酶AnoA的发现与鉴定 | 第36-43页 |
| 2.1.1 anoA基因及其编码蛋白的生物信息学预测 | 第36-37页 |
| 2.1.2 anoA的敲除、互补以及超表达菌株的构建 | 第37-40页 |
| 2.1.3 生长、锑氧化及锑抗性实验 | 第40页 |
| 2.1.4 anoA::lacZ报告基因融合实验 | 第40-41页 |
| 2.1.5 AnoA蛋白的体外表达纯化 | 第41-42页 |
| 2.1.6 AnoA催化Sb(Ⅲ)/As(Ⅲ)氧化的酶反应动力学研究 | 第42-43页 |
| 2.1.7 AnoA在E. coli中异源表达与氧化表型检测 | 第43页 |
| 2.2 非酶促锑氧化机制的研究 | 第43-47页 |
| 2.2.1 qRT-PCR检测非酶促反应相关基因的表达 | 第43-45页 |
| 2.2.2 报告基因融合法检测katA受H_2O_2和Sb(Ⅲ)的诱导表达情况 | 第45-46页 |
| 2.2.3 katA基因的敲除和互补实验 | 第46页 |
| 2.2.4 各菌株的生长氧化和对Sb(Ⅲ)和H_2O_2抗性实验 | 第46页 |
| 2.2.5 Sb(Ⅲ)氧化过程中H_2O_2含量变化检测 | 第46-47页 |
| 2.3 砷氧化酶基因aioA在菌株GW4锑氧化过程中的功能鉴定 | 第47-48页 |
| 2.3.1 报告基因融合法检测aioA基因的表达 | 第47页 |
| 2.3.2 突变株GW4-ΔaioA和GW4-ΔaioA/anoA及互补株的构建 | 第47-48页 |
| 2.3.3 各菌株的生长、锑氧化及对H_2O_2和Sb(Ⅲ)抗性实验 | 第48页 |
| 2.3.4 各菌株内H_2O_2含量的检测 | 第48页 |
| 2.4 加锑条件下砷氧化酶基因aioA对菌株代谢路径和能量代谢的影响 | 第48-51页 |
| 2.4.1 qRT-PCR检测加锑条件下aioA对基因表达的影响 | 第48-49页 |
| 2.4.2 KEGG代谢通路分析 | 第49页 |
| 2.4.3 HPLC检测能量物质NADH和ATP含量 | 第49页 |
| 2.4.4 平板游动法检测细菌对Sb(Ⅲ)和Sb(V)的趋化性 | 第49-50页 |
| 2.4.5 微量热法检测各菌株产热量 | 第50-51页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第51-97页 |
| 1 根癌农杆菌GW4的基因组信息及Sb(Ⅲ)氧化表型分析 | 第51-52页 |
| 2 新型锑氧化酶AnoA的发现与鉴定 | 第52-61页 |
| 2.1 蛋白质组学发现锑诱导上调的氧化还原酶(基因命名为anoA)的生物信息学分析 | 第52-55页 |
| 2.2 anoA基因敲除、互补与超表达 | 第55-56页 |
| 2.3 anoA影响菌株Sb(Ⅲ)氧化速率但其缺失没有导致锑氧化完全丧失 | 第56页 |
| 2.4 anoA受Sb(Ⅲ)诱导并影响Sb(Ⅲ)抗性 | 第56-57页 |
| 2.5 AnoA蛋白体外功能鉴定 | 第57-60页 |
| 2.5.1 AnoA蛋白的表达与纯化 | 第57-58页 |
| 2.5.2 AnoA的酶反应动力学研究 | 第58-60页 |
| 2.6 异源表达AnoA提高了E. coli的Sb(Ⅲ)氧化速率 | 第60页 |
| 2.7 小结：AnoA是首次发现的、以NADP+为辅因子的锑氧化酶 | 第60-61页 |
| 3 胞内H_2O_2介导的非酶促锑氧化机制研究 | 第61-69页 |
| 3.1 荧光定量PCR发现氧化压力相关基因受Sb(Ⅲ)诱导 | 第62-63页 |
| 3.2 katA基因受不同浓度H_2O_2和Sb(Ⅲ)的诱导表达 | 第63页 |
| 3.3 突变株GW4-ΔkatA和互补株GW4-ΔkatA-C的构建 | 第63-65页 |
| 3.4 katA影响GW4菌的生长、锑氧化及酶促反应相关基因转录表达 | 第65-66页 |
| 3.5 katA影响GW4菌的H_2O_2抗性和Sb(Ⅲ)抗性 | 第66-67页 |
| 3.6 H_2O_2氧化Sb(Ⅲ) | 第67-69页 |
| 3.6.1 细菌体内产生的H_2O_2氧化Sb(Ⅲ) | 第67-68页 |
| 3.6.2 H_2O_2在体外氧化Sb(Ⅲ) | 第68-69页 |
| 3.7 小结：H_2O_2作为非酶促因子介导细菌的Sb(Ⅲ)氧化 | 第69页 |
| 4 砷氧化酶基因aioA在菌株GW4锑氧化过程中的功能鉴定 | 第69-77页 |
| 4.1 砷氧化酶基因aioA不受Sb(Ⅲ)的诱导 | 第70-71页 |
| 4.2 aioA的缺失使细菌Sb(Ⅲ)氧化速率加快 | 第71-72页 |
| 4.3 aioA的缺失使H_2O_2和AnoA催化的Sb(Ⅲ)氧化加快 | 第72-73页 |
| 4.4 菌株体内H_2O_2含量与Sb(Ⅲ)氧化速率有显著关联 | 第73-74页 |
| 4.5 aioA和anoA影响菌株H_2O_2和Sb(Ⅲ)抗性 | 第74-75页 |
| 4.6 根癌农杆菌 5A与GW4中Sb(Ⅲ)氧化机制的区别 | 第75-76页 |
| 4.7 菌株GW4的锑氧化机制总结 | 第76-77页 |
| 5 锑条件下砷氧化酶基因aioA对菌株代谢路径和能量产生的影响 | 第77-90页 |
| 5.1 Sb(Ⅲ)条件下菌株GW4和GW4-aioA中表达差异的蛋白 | 第78页 |
| 5.2 转录分析菌株GW4和GW4-aioA在加Sb(Ⅲ)和不加Sb(Ⅲ)条件下表达差异的基因 | 第78-81页 |
| 5.3 Sb(Ⅲ)氧化及抗性相关蛋白上调表达 | 第81-82页 |
| 5.4 aioA的缺失引起细胞内氧化压力增加 | 第82-83页 |
| 5.5 Sb(Ⅲ)氧化过程能量代谢增加 | 第83-86页 |
| 5.6 Sb(Ⅲ)氧化产生的能量部分用于细菌运动和产热 | 第86-87页 |
| 5.7 膦酸酯代谢和磷酸盐转运相关蛋白上调表达 | 第87-88页 |
| 5.8 氨基酸代谢相关蛋白上调表达 | 第88-89页 |
| 5.9 Sb(Ⅲ)氧化过程能量代谢蛋白普遍上调表达，在GW4-aioA中更明显 | 第89-90页 |
| 6 讨论 | 第90-94页 |
| 6.1 锑氧化酶AnoA催化的酶促Sb(Ⅲ)氧化 | 第90-91页 |
| 6.2 胞内H_2O_2介导的非酶促Sb(Ⅲ)氧化 | 第91-92页 |
| 6.3 砷氧化酶AioAB在Sb(Ⅲ)氧化过程中的作用 | 第92-93页 |
| 6.4 异养型锑氧化菌GW4中的能量代谢机制 | 第93-94页 |
| 7 本研究的结论、创新性与展望 | 第94-97页 |
| 7.1 结论 | 第94页 |
| 7.2 创新性 | 第94-95页 |
| 7.3 展望 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-111页 |
| 附录 | 第111-114页 |
| 已发表的论文 | 第114-115页 |
| 参加学术会议及获奖情况 | 第115-116页 |
| 作者简介 | 第116-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
