| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 符号与缩略语说明 | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-32页 |
| 1 阿特拉津的结构及理化性质 | 第14页 |
| 2 除草剂阿特拉津的施用现状 | 第14页 |
| 3 阿特拉津对环境的影响 | 第14-15页 |
| 4 急性毒性和遗传毒性 | 第15-16页 |
| 5 阿特拉津的生物降解 | 第16-17页 |
| 6 阿特拉津脱氯水解酶(TrzN) | 第17-18页 |
| 7 定向进化 | 第18-23页 |
| ·体外定向进化的一般过程和要求 | 第18-19页 |
| ·酶定向进化的策略 | 第19页 |
| ·构建突变体文库的方法 | 第19-21页 |
| ·定点突变,饱和突变 | 第21页 |
| ·PCR介导的定点及饱和突变 | 第21-23页 |
| 8 影响大肠杆菌中外源基因表达的因素 | 第23-25页 |
| ·表达载体的选择 | 第23页 |
| ·外源基因中密码子的使用 | 第23-24页 |
| ·mRNA的一级和二级结构的作用 | 第24页 |
| ·mRNA稳定性的影响 | 第24-25页 |
| ·宿主的选择 | 第25页 |
| 9 mRNA的序列、结构以及翻译速率与蛋白质结构的关系 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-32页 |
| 第二章 突变文库的构建及其方法的选择 | 第32-48页 |
| 1 材料与方法 | 第32-34页 |
| ·菌株与质粒 | 第32页 |
| ·培养基 | 第32页 |
| ·抗生素及使用浓度 | 第32页 |
| ·试剂和酶 | 第32-33页 |
| ·分子生物学操作 | 第33-34页 |
| 2 突变文库构建三种方法的比较分析 | 第34-40页 |
| ·方法一 T7启动子带动trzN的表达,转化E.coli BL21(DE3) | 第34-36页 |
| ·方法二 LacZ启动子带动trzN的表达,转化E.coli DH5α | 第36-39页 |
| ·方法三 利用pRBB表达载体构建突变文库,转化E.coli DH10B | 第39-40页 |
| ·pRBB-trzN(wild)(DH10B)的构建 | 第40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-44页 |
| ·易错PCR条件的摸索 | 第40-41页 |
| ·自配易错PCR buffer与常规PCR buffer扩增比较 | 第41页 |
| ·LacZ promoter+trzN的扩增 | 第41-42页 |
| ·pRBB-trzN(Mus)载体的构建 | 第42-43页 |
| ·pRBB-trzN(wild)(DH10B)的构建 | 第43-44页 |
| 4 实验中文库构建三种方法的比较 | 第44-45页 |
| 5 本章小节 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-48页 |
| 第三章 突变文库的筛选及相关突变位点的研究 | 第48-70页 |
| 第一节 突变文库的筛选 | 第48-50页 |
| 1 材料与方法 | 第48页 |
| ·菌株与质粒 | 第48页 |
| ·抗生素及使用浓度 | 第48页 |
| ·试剂和酶 | 第48页 |
| ·突变文库的筛选 | 第48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-49页 |
| ·几株突变株碱基及氨基酸变化 | 第49页 |
| ·几株突变株碱基及氨基酸变化 | 第49页 |
| 3 本节小结 | 第49-50页 |
| 第二节 突变体基因的重组表达及相关突变位点的研究 | 第50-69页 |
| 1. 材料与方法 | 第50-58页 |
| ·菌株与质粒 | 第50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·抗生素及使用浓度 | 第50页 |
| ·试剂和酶 | 第50-51页 |
| ·突变体基因(MuA-32、MuB-12、MuD-46、MuF-212)的重组表达 | 第51-52页 |
| ·对MuF-212进行回复突变 | 第52-55页 |
| ·MuA-55、MuE-118的回复、定点及饱和突变 | 第55-56页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第56-57页 |
| ·突变体的比酶活力测定分析 | 第57-58页 |
| 2. 结果与分析 | 第58-67页 |
| ·突变体(MuA-32、MuB-12、MuD-46、MuF-212)的表达载体的构建 | 第58-59页 |
| ·MuF-212第377位和第1160位碱基的回复突变 | 第59-61页 |
| ·MuA-55第568位点的回复及trzN(wild)定点突变 | 第61-63页 |
| ·MuE-118第568位点的回复突变 | 第63页 |
| ·蛋白的诱导表达 | 第63-64页 |
| ·突变体比酶活力的测定 | 第64-66页 |
| ·MuA-55第568位点的饱和突变 | 第66-67页 |
| 3 本章总结 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-70页 |
| 第四章 MuA-55、MuE-118、TrzN(wild)酶学性质的初步研究 | 第70-76页 |
| 1 材料与方法 | 第70-71页 |
| ·菌株和质粒 | 第70页 |
| ·培养条件 | 第70页 |
| ·温度和pH值对MuA-55、MuE-118、TrzN(wild)活性及稳定性的影响 | 第70-71页 |
| ·金属离子对MuA-55活性的影响 | 第71页 |
| 2 结果与分析 | 第71-74页 |
| ·pH值对MuA-55、MuE-118、TrzN(wild)活性的影响 | 第71页 |
| ·温度对MuA-55、MuE-118、TrzN(wild)活性的影响 | 第71-72页 |
| ·MuA-55、MuE-118、TrzN(wild)的pH稳定性测定 | 第72页 |
| ·MuA-55、MuE-118、TrzN(wild)的热稳定性测定 | 第72-73页 |
| ·金属离子对MuA-55活性的影响 | 第73-74页 |
| 3 本章总结 | 第74-76页 |
| 全文总结与展望 | 第76-78页 |
| 主要创新点 | 第78-80页 |
| 附录一 文中多用培养基、试剂及相关缓冲液配方 | 第80-83页 |
| 一 培养基 | 第80页 |
| 二 试剂 | 第80-83页 |
| 附录二 文中三种文库构建方法的载体构建图 | 第83-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
