| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 1 引言 | 第16-26页 |
| 1.1 附睾功能基因表达特征 | 第16-17页 |
| 1.1.1 区域特异性 | 第16页 |
| 1.1.2 雄激素调控附睾特异表达基因 | 第16-17页 |
| 1.2 附睾氧化应激 | 第17-18页 |
| 1.3 谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPx5) | 第18-20页 |
| 1.3.1 绵羊附睾GPx5表达特性 | 第19-20页 |
| 1.3.2 绵羊附睾GPx5表达调控 | 第20页 |
| 1.4 附睾上皮细胞的培养与鉴定 | 第20-23页 |
| 1.4.1 细胞培养 | 第20-21页 |
| 1.4.2 附睾上皮细胞培养 | 第21-22页 |
| 1.4.3 上皮细胞的标志一角蛋白 | 第22-23页 |
| 1.5 基因功能研究技术 | 第23-25页 |
| 1.5.1 RNA干扰研究进展 | 第23-24页 |
| 1.5.2 RNAi的特征及方法 | 第24页 |
| 1.5.3 腺病毒载体的优缺点 | 第24-25页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 2 GPx5在绵羊附睾组织中的时空表达特性 | 第26-50页 |
| 2.1 试验材料 | 第27-28页 |
| 2.1.1 实验动物及组织处理 | 第27页 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 | 第27-28页 |
| 2.2 试验方法 | 第28-32页 |
| 2.2.1 总RNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.2 cDNA的合成 | 第28-29页 |
| 2.2.3 目的基因荧光定量PCR | 第29-30页 |
| 2.2.4 总蛋白的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.5 目的蛋白和内参蛋白免疫印迹试验 | 第31页 |
| 2.2.6 免疫印迹和显影 | 第31页 |
| 2.2.7 免疫荧光试验 | 第31-32页 |
| 2.2.8 数据处理及分析 | 第32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-48页 |
| 2.3.1 质检总RNA及RT-PCR检测 | 第32-34页 |
| 2.3.2 实时荧光定量的结果 | 第34-35页 |
| 2.3.3 GPx5基因的时空特异表达分析 | 第35-36页 |
| 2.3.4 免疫印迹结果 | 第36-39页 |
| 2.3.5 免疫荧光结果 | 第39-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-50页 |
| 3 外源雄激素促进绵羊附睾GPx5基因的表达 | 第50-59页 |
| 3.1 材料与方法 | 第50-53页 |
| 3.1.0 试验动物及组织样品采集 | 第50-51页 |
| 3.1.1 主要仪器 | 第51页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第51页 |
| 3.1.3 血清及附睾头部组织T、DHT测 | 第51-52页 |
| 3.1.4 附睾头部AR的测定 | 第52页 |
| 3.1.5 附睾头部总RNA的提取 | 第52页 |
| 3.1.6 目的基因荧光定量试验 | 第52-53页 |
| 3.1.7 免疫印迹 | 第53页 |
| 3.1.8 统计分析 | 第53页 |
| 3.2 结果与分析 | 第53-57页 |
| 3.2.1 绵羊血清及附睾T、DHT含量 | 第53-55页 |
| 3.2.2 丙酸睾酮处理后对绵羊附睾GPx5基因及AR mRNA的相对表达 | 第55-56页 |
| 3.2.3 丙酸睾酮处理后对绵羊附睾AR及GPx5基因蛋白相对表达 | 第56-57页 |
| 3.3 讨论 | 第57-59页 |
| 4 绵羊附睾上皮细胞的培养与鉴定 | 第59-70页 |
| 4.1 实验材料 | 第59-62页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第59页 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 | 第59-60页 |
| 4.1.3 附睾上皮细胞的分离培养 | 第60页 |
| 4.1.4 上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化 | 第60页 |
| 4.1.5 细胞生长曲线的绘制 | 第60-61页 |
| 4.1.6 附睾上皮细胞的鉴定 | 第61页 |
| 4.1.7 RT-PCR检测GPx5基因在附睾上皮细胞上的表达 | 第61页 |
| 4.1.8 GPx5蛋白在附睾上皮细胞的定位 | 第61-62页 |
| 4.1.9 细胞的冻存与复苏 | 第62页 |
| 4.2 结果与分析 | 第62-68页 |
| 4.2.0 附睾上皮细胞形态观察 | 第62-63页 |
| 4.2.1 附睾上皮细胞的纯化传代 | 第63-64页 |
| 4.2.2 附睾上皮细胞的生长曲线 | 第64-65页 |
| 4.2.3 附睾上皮细胞角蛋白CK18的鉴定 | 第65页 |
| 4.2.4 RT-PCR检测GPx5基因在附睾上皮细胞上的表达 | 第65-67页 |
| 4.2.5 附睾上皮细胞GPx5的定位 | 第67-68页 |
| 4.2.6 附睾上皮细胞的冷冻与复苏 | 第68页 |
| 4.3 讨论 | 第68-70页 |
| 4.3.1 附睾上皮的分离与培养 | 第68-69页 |
| 4.3.2 上皮细胞的纯化及鉴定 | 第69页 |
| 4.3.3 附睾上皮细胞GPx5基因的表达 | 第69页 |
| 4.3.4 附睾上皮细胞的冷冻与复苏 | 第69-70页 |
| 5 靶向绵羊GPx5基因的shRNA重组干扰腺病毒的制备及鉴定 | 第70-86页 |
| 5.1 试验材料 | 第71-72页 |
| 5.1.1 细胞和质粒 | 第71页 |
| 5.1.2 实验试剂及仪器 | 第71-72页 |
| 5.2 试验方法 | 第72-79页 |
| 5.2.1 GPx5-shRNA的构建 | 第72-77页 |
| 5.2.2 目的细胞腺病毒的感染 | 第77页 |
| 5.2.3 检测GPx5 mRNA和蛋白表达量 | 第77-79页 |
| 5.3 结果与分析 | 第79-84页 |
| 5.3.1 酶切鉴定及测序分析结果 | 第79-81页 |
| 5.3.2 GPx5 shRNA感染性滴度检测结果 | 第81页 |
| 5.3.3 腺病毒感染附睾上皮细胞 | 第81-82页 |
| 5.3.4 Ad-GPx5 shRNA1、Ad-GPx5 shRNA2、Ad-GPx5 shRNA3干扰效率的RT-QPCR检测 | 第82-83页 |
| 5.3.6 氧化指标的测定 | 第83-84页 |
| 5.4 讨论 | 第84-86页 |
| 6 结论 | 第86-88页 |
| 6.1 主要研究结果 | 第86-87页 |
| 6.2 创新点 | 第87-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-96页 |
| 作者简介 | 第96页 |
