| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-18页 |
| ·NODAL 分子概述 | 第12-14页 |
| ·Nodal (含 Squint)的发现 | 第13页 |
| ·Nodal 的生理功能 | 第13-14页 |
| ·研究 Nodal 分子的意义 | 第14页 |
| ·激活素(ACTIVIN)概述 | 第14-16页 |
| ·Activin 的免疫功能 | 第15-16页 |
| ·鱼类中研究 activin 免疫功能的必要性 | 第16页 |
| ·本论文主要研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 草鱼 SQUINT 的重组表达及纯化 | 第18-38页 |
| ·实验材料 | 第18-20页 |
| ·实验动物 | 第18页 |
| ·菌种和质粒 | 第18页 |
| ·主要实验仪器和设备 | 第18页 |
| ·主要试剂 | 第18-19页 |
| ·主要溶液配制 | 第19-20页 |
| ·实验方法与操作 | 第20-26页 |
| ·草鱼总 RNA 提取 | 第20-21页 |
| ·反转录合成 cDNA 模板 | 第21页 |
| ·引物设计 | 第21-22页 |
| ·草鱼 squint cDNA 序列的克隆 | 第22页 |
| ·目的基因片断的克隆与测序 | 第22页 |
| ·生物信息学分析 | 第22-23页 |
| ·Real-time PCR 检测组织分布情况 | 第23页 |
| ·胶回收产物和载体的酶切 | 第23-24页 |
| ·质粒 DNA 的小量抽提 | 第24页 |
| ·重组质粒的诱导表达 | 第24-26页 |
| ·重组子的获取 | 第24页 |
| ·诱导表达条件 | 第24-25页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第25页 |
| ·Tricine SDS PAGE 电泳 | 第25-26页 |
| ·Western Blot | 第26页 |
| ·融合蛋白的分离纯化 | 第26页 |
| ·实验结果与分析 | 第26-35页 |
| ·草鱼 squint 的分子克隆 | 第26-30页 |
| ·pET30a(+)/mSQT 表达质粒的构建和鉴定 | 第30-31页 |
| ·诱导表达及条件优化 | 第31-34页 |
| ·融合蛋白的纯化与鉴定 | 第34-35页 |
| ·本章小结 | 第35-38页 |
| 第三章 草鱼重组 SQUINT 的生物学活性研究 | 第38-46页 |
| ·实验材料 | 第38-39页 |
| ·细胞 | 第38页 |
| ·主要试剂及其配制 | 第38页 |
| ·实验仪器 | 第38-39页 |
| ·主要实验方法 | 第39-41页 |
| ·草鱼垂体原代细胞的分离与培养 | 第39页 |
| ·不同剂量 rgcmSQT 对草鱼垂体细胞中相关基因表达的影响 | 第39-40页 |
| ·rgcmSQT 处理不同时间对草鱼垂体细胞中相关基因表达的影响 | 第40页 |
| ·数据统计分析 | 第40-41页 |
| ·结果 | 第41-44页 |
| ·rgcmSQT 对垂体细胞中 GH/LH /PRL/FSH mRNA 水平的影响 | 第41页 |
| ·rgcmSQT 对草鱼垂体细胞中 ActRIB/ActRIIB 转录水平的影响 | 第41-43页 |
| ·rgcmSQT 对草鱼垂体细胞中 activin A/ B 转录水平的影响 | 第43-44页 |
| ·本章小结 | 第44-46页 |
| 第四章 草鱼激活素 A 和 B 的原核表达及分离纯化 | 第46-56页 |
| ·实验材料 | 第46页 |
| ·实验方法 | 第46-50页 |
| ·引物设计 | 第46-47页 |
| ·高保真酶 PCR 扩增 | 第47页 |
| ·质粒构建 | 第47页 |
| ·诱导表达 | 第47-48页 |
| ·重组表达蛋白的纯化 | 第48-49页 |
| ·包涵体的准备 | 第48页 |
| ·包涵体蛋白的透析复性 | 第48页 |
| ·复性蛋白的分子筛层析纯化 | 第48页 |
| ·柱上复性法 | 第48-49页 |
| ·重组蛋白 rgcACVA/rgcACVB 的生物学活性鉴定 | 第49-50页 |
| ·实验结果 | 第50-54页 |
| ·重组表达质粒 pET30a(+)-rgcACVA/rgcACVB 的构建 | 第50页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第50-51页 |
| ·透析复性法获得 rgcACVA | 第51页 |
| ·柱上复性法获得 rgcACVB | 第51-52页 |
| ·rgcACVA/rgcACVB 对草鱼 HKLs 中 SMAD2 磷酸化水平的影响 | 第52-54页 |
| ·本章小结 | 第54-56页 |
| 第五章 草鱼激活素 A 的真核表达 | 第56-62页 |
| ·实验材料 | 第56-57页 |
| ·实验方法 | 第57-59页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第57页 |
| ·质粒线性化 | 第57页 |
| ·转化 | 第57页 |
| ·Screening for Mut+表型和 Pichia 整合重组子 | 第57-58页 |
| ·重组子的诱导表达 | 第58页 |
| ·转印法筛选高效表达重组子 | 第58-59页 |
| ·实验结果 | 第59-60页 |
| ·质粒构建 | 第59页 |
| ·重组子 pPIC9K-rgcA 的获取 | 第59-60页 |
| ·诱导表达 | 第60页 |
| ·本章小结 | 第60-62页 |
| 第六章 激活素 A 参与草鱼免疫反应的研究 | 第62-69页 |
| ·实验材料 | 第62页 |
| ·实验动物和细胞 | 第62页 |
| ·主要试剂 | 第62页 |
| ·主要仪器和设备 | 第62页 |
| ·实验方法 | 第62-64页 |
| ·A.hydr 的培养 | 第63页 |
| ·A.hydr 感染草鱼及样品采集 | 第63页 |
| ·草鱼头肾白细胞（HKLs）的分离 | 第63-64页 |
| ·草鱼外周血淋巴细胞(PBLs)的分离 | 第64页 |
| ·实验结果 | 第64-67页 |
| ·A.hydr 感染的草鱼中激活素亚基 INHBA 的 mRNA 表达上调 | 第64-65页 |
| ·LPS 刺激草鱼 PBLs 中 INHBA 的 mRNA 表达 | 第65-66页 |
| ·草鱼垂体细胞, HKLs, PBLs 和 CIK 中 activin 受体 mRNA 的表达 | 第66页 |
| ·rgcACVA 抑制 LPS 引起的草鱼 HKLs/PBLs 中炎症基因的上调反应 | 第66-67页 |
| ·本章小结 | 第67-69页 |
| 第七章 结论 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-78页 |
| 攻硕期间取得的研究成果 | 第78-79页 |
